细胞在发生大规模形态变化之前，首先在细胞水平引起代谢的变化。如果能够识别细胞的代谢状态，将有助于早期癌症的诊断。双光子自发荧光显微成像能够达到细胞水平分辨率，在早期宫颈癌的检测中获得令人鼓舞的结果，因此极大地促进了手持式探头的发展。较弱的自发发射荧光强度是阻碍双光子自发荧光成像临床转化的一个重要挑战，在临床环境中组织散射和成像深度还会进一步削减荧光强度。本文研制了一种独特设计的成像探头，在高散射和深成像条件下高效收集双光子激发的荧光并对细胞代谢成像，有望在临床环境中检测早期宫颈癌[1]。
图1 探头的光学机械设计。a) 远端光学器件的侧截面图，显示收集光纤的角度弯曲和端接。b) 远端光学器件的三维渲染视图，收集光纤与物镜由SLA印刷光纤支架（黄色）包围。c) 探头设计的侧面截面图。d) 工作距离(WD)恒定，通过轴向驱动改变成像深度(ID) [1]
图1展示了探头的光学机械设计，前半部分为侵入性元件，主要用作探测，后半部分用来手持。由图1(a)可知，探头的前半部分由压电致动器管、激发光纤、物镜组和收集光纤组成。其中，12根多模光纤(NA=0.5)以一定角度弯曲径向排列在物镜周围，起收集自发发射荧光的作用，探头的激发路径与收集路径完全独立。
图1(d)展示了如何改变成像距离（imaging distance, ID）对不同深度的组织成像。首先激光经过物镜组聚焦到样品的距离(working distance, WD)是固定的，WD指的是物镜表面到焦点的距离，ID是装置外壳表面到焦点的距离。由图1(c)可知，装置的后半部分安装有直流伺服电机，可以满足6毫米轴向驱动和亚微米运动分辨率。当驱动电机，电机产生的轴向驱动力将通过装置中的弹簧和滚珠传递到前端光学元件改变成像距离ID，从而对不同深度的上皮组织成像。在成像深度为50 um、光纤角度25°的条件下，作者比较了本文所采用的探头设计方案与双包层光纤(double cladding fiber，DCF)收集方案的收集效率。
DCF方案是指将纤芯用于传输激发脉冲，内包层用于自发荧光收集。利用DCF采集自发荧光是一种常见设计方案，可以使收集元件与焦点轴向对齐，但是商用双包层光纤的尺寸限制了总体可实现的收集面积，导致收集效率和成像深度受限。观察DCF的收集路径，虽然激发物镜可以收集相当大比例的发射光子(31.8%在前端)，但只有1.39%的光子可以到达DCF的二次包层。虽然本文探头的每根收集光纤的收集效率仅为0.52%，但位于物镜周围的所有12根光纤加起来为6.24%。12根光纤与PMT的光阴极耦合，从而将收集的荧光传递到PMT。图2展示了组装完毕的探头，组装好的探针安装在三轴平移台上。钛宝石激光器的可调波长设置为775 nm，脉冲持续时间为100 fs，重复频率为80 MHz，在实验中用作激励源。
图2 探头的光机设计 [1]
作者利用探头在不同浓度的荧光素溶液中产生由双光子激发产生的荧光，并记录由PMT、前置放大器和数据采集卡组成的读出模块获取的电压水平，并与台式显微镜对比。图3(a)的线性拟合的斜率表明，探头系统的总体收集效率达到了显微镜所能提供的系统收集效率的55%。图3(b)总结了系统不同部分的分析结果。图3(c)展示了不同成像深度下的归一化荧光衰减结果。图3(d)的橙色线条是荧光强度随FOV半径的变化，蓝色线条展示了在不同径向位置测量到的物镜渐晕导致的激发功率径向降低，强度降低与功率平方曲线密切相关，表明收集效率的径向依赖性较低。
图3 探针的收集效率表征 [1]
图4展示了探头对花粉粒团成像的结果，所有图像的FOV均为120 µm，并为10帧图像的平均值。这组图像证实本文的探头具有分辨精细特征的能力以及轴向扫描操作的稳定性。
图4 使用探头以15 mW的平均激光功率照射样品表面并轴向扫描，获得的花粉粒团不同轴向深度的双光子图像 [1]猪声带组织与宫颈组织的粘膜上皮非常接近，因此作者利用探头对猪声带组织不同深度成像。从图5可以看到，上皮层由具有明亮细胞质和深色细胞核特征的鳞状细胞构成，在成像深度约50 µm以下的浅层固有膜中，纤维胶原层让位于上皮层。
图5 探头在切除的猪声带组织样本中不同成像深度获得的自发荧光图像 [1]
总之，本文提出一种适用于自发荧光收集的探头设计方案，能够在深成像和高散射情况下具有较高的收集效率。这种探头如果能应用于临床，将有可能在早期癌症检测方面实现重大突破。
参考文献：
[1] Berk Camli, Liam Andrus, Aditya Roy, Biswajit Mishra, Chris Xu, Irene Georgakoudi, Tomasz Tkaczyk, and Adela Ben-Yakar, "Two photon imaging probe with highly efficient autofluorescence collection at high scattering and deep imaging conditions," Biomed. Opt. Express 15, 3163-3182 (2024)
