前言
肿瘤免疫治疗是通过人体免疫系统恢复或增强对肿瘤的自然防御的一种治疗方法。这种治疗通常针对癌细胞表面的特定生物分子，如肿瘤相关抗原（TAAs）。抗肿瘤活性是通过将宿主免疫系统导向TAAs来实现的，从而建立或诱导针对癌细胞的适应性免疫反应。在过去的几十年里，利用单克隆抗体（Mab）治疗癌症取得了巨大的成功，其中许多已经被批准用于癌症治疗或临床试验。
4－1BB于1989年被鉴定为一种诱导基因，在抗原启动的T细胞上表达，而在静止的T细胞上不表达。此外，已知其在树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NKs）、活化的CD4＋和CD8＋T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤T细胞（NKT）和肥大细胞中表达，但骨髓源性抑制细胞（MDSCs）在其表面不表达该分子。抗4－1BB抗体具有激活细胞毒性T细胞和增加γ干扰素（IFN－γ）生成的能力，靶向4－1BB的双抗和多抗在抗癌方面显示出巨大的潜力。
4－1BB的分子特性
肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）是一个由29个成员组成的蛋白质超家族，在人类免疫系统中发挥着重要作用。这个分子家族分为两类：死亡受体（8个成员）和激活受体。它们都含有一个细胞内信号通路激活域和一个细胞外受体位点。这些受体位点可通过与肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的相应配体结合来激活。已有研究表明，TNFSF－TNFRSF的配体受体（如CD40－CD40L、CD27－CD70或OX40－OX40L）信号通路可以调节体内许多重要的过程，如细胞的发育和死亡，细胞因子和趋化因子的诱导。越来越多的证据表明，TNFRSF和TNFSF成员参与了包括癌症在内的多种疾病的炎症和病理学。因此，针对TNFSF和TNFRSF配体－受体相互作用的免疫治疗技术在癌症治疗中具有很高的潜力。
在免疫治疗中，有效的免疫反应需要两种生物信号来充分激活T细胞和其他免疫细胞。第一种信号即抗原特异性信号，是由淋巴细胞受体与抗原呈递细胞（APCs）上主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的特异性肽相互作用而产生的。第二种是非抗原特异性的共刺激信号。这种类型的信号是通过T细胞和APCs上表达的共刺激分子之间的相互作用提供的。4－1BB是一种共刺激分子，属于TNFRSF。它是在80年代末进行T细胞因子筛选时，对小鼠辅助T细胞和细胞毒性T细胞用刀豆球蛋白A刺激发现的。人4－1BBL于1994年首次通过直接表达克隆从活化的CD4＋T淋巴细胞群中分离出来。4－1BBL主要在树突状细胞、B细胞或巨噬细胞上表达。
在小鼠中，4－1BB／4－1BBL激活导致TNFR因子（TRAF1和TRAF2）的募集，从而导致活化B细胞的NF－κB、JNK／SAPK和p38 MAPK通路的激活。这会产生共刺激信号来诱导CD4＋和CD8＋T淋巴细胞的活性，其中对CD8＋T细胞的增殖更有利。通过p38 MAPK激活CD4＋T淋巴细胞对于辅助性T细胞（Th）1和2的发育以及Th1效应细胞的调节也是必不可少的。试验证明，4－1BB的激动剂单克隆抗体可向CD8＋T淋巴细胞提供长期存活信号，从而抑制活化诱导的细胞死亡（AICD）。4－1BB／4－1BBL通路也影响免疫系统中的非T细胞，包括通过放大单核细胞介导的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）的增殖来控制单核细胞数量。4－1BB和／或4－1BBL激动剂可刺激脂肪细胞和巨噬细胞产生多种炎症细胞因子，如IL－6、TNF－α和MCP－1。B细胞上4－1BB交联产生共刺激信号，激活并诱导B细胞增殖。
4－1BB靶向药物的开发
BMS的4－1BB抗体药物 Urelumab（BMS－663513）是第一个进入临床试验的靶向4－1BB治疗药物，其是一种IgG4 单克隆抗体。Urelumab最初的临床结果发表于2008年，有着令人鼓舞的疗效。但Phase1和Phase2阶段的数据显示出肝脏毒性，并且似乎与药物靶标和剂量有关，因此临床开发受到了阻碍。Urelumab于2012年重新进入临床试验，目前正在进行研究Urelumab联合其他药物共同治疗胶质母细胞瘤、胰腺癌等实体瘤的潜力。
Utomilumab（PF－05082566）是辉瑞开发的4－1BB人源化IgG2单克隆抗体，相对于Urelumab，其具有更高的安全性，目前也正在进行多项临床试验中。除了以上两个，还有一些公司布局该领域，包括双特异性抗体，比如BioNTech，Aptevo等。
观之国内，也有部分4－1BB抗体领先企业，并且关于4－1BB药物的研究也越来越多。2018年，天演药业的针对4－1BB靶点的激动型全人源单克隆抗体 ADG106已在中美同时获得临床试验批件，开展 I 期临床。2019年10月23日，无锡智康弘义申报临床的4－11BB抗体WBP3425获得NMPA受理，成为国内第二家申报该靶点抗体的公司。2020年4月16日，上海怀越生物4－1BB抗体药物PE0116的临床试验申请获得NMPA受理，受理号为CXSL2000070，成为国内第三款申报临床的国产4－1BB抗体。
另外，国内也有部分公司在布局PD－L1／4－1BB双抗，如科望生物从Inhibrx公司引进的ES101、天境生物的TJ－L14B、以及德琪医药的ATG－101等。
4－1BB激动剂抗体的单药治疗
4－1BB抗体在动物体内预防癌症的效果促进了临床的开发。在一项临床前研究中，一种与4－1BB胞外域结合的人IgG2，即PF－05082566，可以有效地防止异种移植人类癌症模型的进展。这种抗4－1BB抗体激活NF－κB，诱导人和猴白细胞产生下游细胞因子，并促进猴CD8＋T细胞增殖。抗4－1BB单抗已被考虑用于晚期癌症患者的临床试验，但由于4－1BB受体上抗4－1BB抗体结合位点的物种间差异，其抗癌能力应该是多变的。具体地说，它的结合作用仅限于富含半胱氨酸结构域（CRD），并且在小鼠和人之间存在差异。小鼠4－1BBL主要与CRDII结合，人4－1BBL主要与CRDIII结合。简言之，人和小鼠的4－1BB CRD有四个CRD（CRDI，II，III和IV）。CRDI和CRDIV区都只含有4种半胱氨酸，不能形成典型的CRD结构，而CRDII和CRDII都含有6种半胱氨酸，可以形成典型的CRD结构。
目前，针对两种抗4－1BB单克隆抗体，即urelumab（BMS－663513）和utomilumab（PF－05082566）正在进行两项临床试验。它们是分别由百时美施贵宝和辉瑞公司开发。在一项临床前研究中，Urelumab显示了一种很有前途的癌症治疗潜力。然而，抗体的肝脏毒性在随后不久出现，这导致了2008年12月至2012年2月期间，urelumab开发计划被搁置。这种毒性主要是由于肿瘤和基质细胞分泌的S100A4蛋白所致。最近的研究表明，每3周每名患者注射8毫克或0．1毫克／千克的抗体是安全的。
与urelumab相比，utomilumab在27名癌症患者队列中没有观察到剂量限制性毒性（DLT）或肝酶升高。最近，utomilumab治疗55例晚期癌症患者的I期试验结果出来了。试验数据支持了utomilumab耐受性良好的安全性，每4周在10mg／kg的剂量水平下未观察到DLT。除此之外，大多数患者出现1级或2级以下的不良事件。实体瘤患者总客观响应率为3．8％，最佳总有效率为24．5％，其中完全缓解1例。在临床环境下，urelumab或utomilumab的毒性差异的机制已经比较清楚，这可能是由于它们的激动剂活性或4－1BB结合特性的机制差异所致。utomilumab和urelumab结合受体结构的比较表明，单抗在表位和相对取向上具有明显不同的结合位点。utomilumab沿着4－1BB侧结合，在CRD III和IV的交界处接触。相比之下，urelumab结合在CRD I上4－1BB受体的N端。使用剂量减少的Ureumab单药治疗的临床疗效结果基本无效，并且在耐受剂量下，Urelumab的临床活性有限。虽然有报道称，utomilumab具有更好的安全性，但相对于urelumab，它是一种药效较弱的4－1BB激动剂。由于其较好的安全性，与urelumab相比，utomilumab是联合治疗的首选单抗。
在血液肿瘤中，抗4－1BB抗体的单一免疫治疗在某些模型中可以调节血液恶性肿瘤。在多发性骨髓瘤小鼠模型中，与对照组相比，该抗体可挽救治疗组40－50％的小鼠。抗4－1BB单抗还抑制了50％实验动物的急性髓系白血病（AML）的生长。抗4－1BB单克隆抗体的这些抗血液肿瘤的结果是由于CD8＋ T细胞和IFN－γ的增加。
靶向4－1BB的双抗
在针对TNFRSF共刺激受体的临床试验中，4－1BB似乎是最有希望的靶点。为了在维持药效的同时降低全身性4－1BB激动剂对肝脏的毒性，用同时与肿瘤相关抗原（TAA）结合的双特异性分子靶向4－1BB，将4－1BB＋T细胞激动剂限制在肿瘤微环境中似乎是一种理想的方法。
首先，只有暴露抗原的T细胞（4－1BB＋T细胞）参与靶向TAA，因此，靶向非肿瘤毒性的细胞因子释放综合征（CRS）可以最小化。
第二，4－1BB靶向双特异性抗体可能比CD3靶向双特异性抗体对抗原丢失更耐受，因为4－1BB刺激可独立于MHC或抗原扩增肿瘤反应性记忆T细胞。记忆性T细胞池扩大了，就可以识别多种肿瘤抗原。
最后，相比CD3＋T细胞导向，4－1BB的激活可以减轻T细胞衰竭。数据表明，4－1BB共刺激可恢复小鼠耗尽的CD8＋TIL的功能，延长细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的持续时间，增强CTL功能。
GEN1046
是一种靶向PD－L1和CD137的双特异性抗体。PD－L1作为TAA，同时GEN1046也抑制PD－L1通路的信号。在1期临床实验中，虽然未达到MTD，但报告了3级肝毒性。在接受有效剂量治疗的56名患者中有4例PRs，DCR 65．6％。在队列扩展试验中，观察到了先前使用检查点抑制剂治疗的NSCLC患者的初步抗肿瘤疗效。这两项研究支持CD137靶向双特异性分子在实体瘤中的应用。
ES101
ES101最初由Inhibrx公司开发，科望医药引进其大中华区权益。ES101是一个靶向PD－L1／4－1BB的四价双特异性抗体，包含4个结合域，其中两个靶向PD－L1，另外两个靶向4－1BB。
ES101与肿瘤细胞表面的PD－L1结合，可以解除PD－1／PD－L1介导的免疫检查点抑制效应；另一方面ES101也可以结合T细胞表面的4－1BB，但是只有当ES101结合了PD－L1之后，4－1BB结合域才有可能驱动4－1BB分子在T细胞表面的聚集，这就使得4－1BB介导的免疫激活效应集中于肿瘤附近的T细胞，有效降低了潜在的脱靶毒性。ES101目前处于2期临床试验阶段。
TJ－CD4B
TJ－CD4B（又称ABL111），是由天境生物与韩国ABL Bio双方合作开发的靶CLDN18．2和4－1BB的双特异性抗体，已经获FDA批准开展临床研究。
TJ－CD4B具有独特4－1BB结合表位，使其仅在与Claudin 18．2结合时才会激活T细胞。TJ－CD4B的这一特性既增强了抗肿瘤免疫力，也降低了因4－1BB广泛表达而过度激活T细胞引起的肝毒性风险和降低全身免疫反应风险。
TJ－L14B
TJ－L14B是天境生物另一款创新双抗产品，同时靶向PD－L1和4－1BB，通过阻断PD－L1信号并刺激4－1BB信号，激活T细胞产生抗肿瘤协同作用。临床前研究表明，在给药剂量相同的前提下，TJ－L14B的抗肿瘤活性既优于PD－L1抗体或4－1BB抗体的单药或联合治疗又非常持久。天境生物已于2021年4月在美国启动了TJ－L14B用于治疗局部晚期或转移性实体瘤的1期临床试验（NCT04762641）。
PM1003
PM1003是一款靶向PD－L1和4－1BB的双特异性抗体，根据药审中心CDE官网公示，普米斯生物的PM1003注射液的临床试验申请获批，拟用于治疗晚期恶性实体瘤。
ATG－101
ATG－101是一种新型PD－L1／4－1BB双特异性抗体，拟用于治疗血液系统恶性肿瘤及实体瘤。目前，ATG－101正在转移性／晚期实体瘤和成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中，开展首次人体1期试验。
PRS－343
PRS－343是一种靶向HER2和4－1BB的双特异性分子，目前正在进行HER2阳性实体瘤的I期临床研究。在接受有效剂量治疗的患者中（n＝33），12％的患者达到ORR，包括1个CR，疾病控制率（DCR）为52％，没有DLT报告。
引人注目的是，在中枢神经系统中也没有CRS或毒性的报道，这突出了4－1BB靶向与CD3靶向双特异性化合物的进一步优势。PRS－343在临床上与atezolizumab联合应用也有报道，但联合应用似乎缺乏叠加效应。
除了双抗药物外，针对4－1BB靶点的研发已延伸至三抗与四抗。NM21－1480是一种针对PD－L1、4－1BB和人血清蛋白的单价三特异性抗体片断分子，原研为瑞士生物技术公司Numab，国内权益归属基石药业。NM21－1480可发挥PD－L1阻断以及4－1BB激动的协同效应，此外，通过结合HSA 可延长其半衰期，从而降低给药频率。。根据Numab于2018年在AACR上公布的临床前数据，ND021在有效性及安全性方面优于PD－1／PDL1阻断剂及其与针对共刺激受体的抗体的结合。2021年7月，NM21－1480中国临床试验申请获受理。
百利药业深度布局四抗药物。GNC－035是一款靶向PD－L1×CD3×4－1BB×ROR1的四抗药物， GNC－039靶向PD－L1×4－1BB×CD3×EGFR，两款药物均处于Ⅰ期临床研究。在设计上，GNC－035和GNC－039均在 IgG 基础上串联 3 个 scFv 搭建对称的四特异性抗体。其中 PD－L1、4－1BB、CD3 为免疫调节功能，第 4 靶点为肿瘤抗原。
4－1BB靶向治疗实体瘤的挑战
首先，有必要建立一个可转化的临床前模型，可以预测临床安全性和反应。除了癌症类型的免疫反应外，了解器官特异性免疫反应也很重要。此外，还有优化免疫细胞激活的方面，包括优化药物的分子大小，以穿透肿瘤并激活肿瘤环境中的T细胞，这是至关重要的。
然而，如果分子的大小足够小，那么其在循环系统中的持续时间可能不足以有效到达肿瘤。为了通过降低较小的双特异性分子的肾清除率来实现更好的药物递送，可以使用与白蛋白结合的形式。CB307和NM21－1480都使用HSA偶联的结构，目前正在I期临床试验中进行研究。另外，由于T细胞持续暴露于抗原可能导致T细胞衰竭，因此确定哪种治疗半衰期最合适尚不清楚。为了回答这个问题，可能需要对多种给药方案进行临床研究。
临床试验中4－1BB靶向分子患者选择的优化也需要探索。4－1BB＋TIL在多种实体瘤中的表达已在mRNA水平检测到，然而迄今为止，还没有基于4－1BB＋TIL信息对4－1BB靶向药物进行的前瞻性临床试验。这是因为4－1BB表达的动态性使得很难获得确定的结果，事实上，没有数据表明对4－1BB单抗的反应与肿瘤微环境中4－1BB的表达水平相关。
对于PRS－343，在观察到CD8＋T细胞扩增的剂量水平上可以看到临床反应，然而，CD8＋T细胞扩增可能被证明是临床疗效的必要条件，但不是充分条件，因为即使观察到CD8＋T细胞扩增，其他患者也没有看到临床反应。了解补偿途径，以最大限度地发挥T细胞的细胞毒活性，同时保持适当的安全边际将需要进一步的研究，以为成功的联合治疗铺平道路。
最后，4－1BB激活产生记忆T细胞的有效方法，可能是持久的抗癌免疫效果的关键，因为记忆T细胞不会耗竭。
小结
4－1BB作为一种免疫肿瘤靶点非常具有吸引力，并且根据现有的临床资料，它仍然是TNFRSF中T细胞共刺激受体中最有希望的靶点之一。目前对下一代4－1BB靶向分子的第一阶段研究致力于在不影响药效的前提下解决肝毒性问题。
了解4－1BB治疗患者的生物学特性以及选择患者以优化临床反应的策略对于4－1BB靶向药物的未来成功至关重要。4－1BB的双抗策略将为肿瘤免疫治疗开辟一条新的道路。
