Molecular Devices
引言
生物治疗药物和治疗性蛋白质的市场在 2018 年价值 931．4 亿美元，预计到 20221年底将增长近一倍。然而，对高产哺乳动物 CHO 细胞株的选择仍然代表着生物制药生产过程开发中的主要瓶颈 2 。因此，开发新的高通量方法以有效和具有成本效益的方式选择高表达的 CHO 细胞株变得越来越重要。
使用多轮甲氨蝶呤 （ MTX ） 或蛋氨酸亚砜亚胺 （ MSX ） 诱导的基因扩增和有限稀释的传统方法效率低下，费时，费力，并且并不总是能产生具有所需生产水平的克隆。FACS 的筛选方法可以提高效率和通量，但需要大量的资金投入，密集的操作员培训和专门的人员。FACS 工作流由于与细胞直接接触的非一次性组件而容易受到交叉污染。
此外，对于对流体压力敏感的细胞株，细胞可能显示出较低的生存力，并且在 FACs 筛选后不能很好地恢复。
优势
提供有效且快速的过程来产生重组 CHO 细胞株，产生高水平的治疗性蛋白质
在更早的克隆阶段确定所需的克隆
评估无标签的治疗性蛋白质表达
避免使用特异性抗体进行筛查
轻松实施到任何细胞株开发过程中
在本研究中，使用 CloneSelect® Single－Cell Printer f． sight™ 和带有荧光报告基因的 CHO 细胞系，用于快速，早期鉴定产生高水平治疗性蛋白质——重组人白介素 15（tr－hIL15）的克隆。编码 tr－hIL15 和报告蛋白的基因通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，因此它们可以在同一 mRNA 中转录，但可以独立翻译。由于它们来自相同的 mRNA 分子，因此报告蛋白的表达水平可用于预测每个克隆的治疗性蛋白的相对表达水平。
Molecular Devices
材料和方法
重组 DNA 质粒的构建
为了重组 tr－hIL15 蛋白与增强的绿色荧光蛋白 （EGFP） 共表达，将相应的 tr－hIL15 开放阅读框插入到巨细胞病毒（CMV）启动子下游和 IRES 上游的哺乳动物表达载体中， 随后插入 EGFP 开放阅读框和 SV40 polyA （图 1）。为了降低 IRES 序列的翻译起始效率，删除了 ATG11 和 ATG123－4 。重组质粒包含用于选择稳定 CHO 细胞株的 zeocin 抗性基因表达盒，所有基因合成，随后的克隆和测序均由 GenScript（Piscataway ， NJ）进行。
图 1 基因表达盒示意图。编码治疗蛋白和 EGFP 报告基因的 DNA 通过内部核糖体进入位点 （IRES） 连接，因此它们在同一 mRNA 中转录，独立地翻译成两种蛋白质。
细胞培养和转染
除了另外说明，其他所有试剂和实验室用具均来自 Thermo Fisher Scientific，例如 FreeStyleTM CHO－S 细胞系。使用 125 mL 通 气盖摇瓶在 37℃，5％ CO2、70－80％ 湿度和 125rpm 摇动下，使细胞在悬浮液中生长。所用的生长培养基是补充有 4mM L－ 谷氨酰胺的 XP CHO Growth A 培养基（Molecular Devices）。
使用线性化的 tr－IL15－IRES－EGFP 质粒和对照的 Neon 转染系统（Thermo Fisher Scientific）通过电穿孔法转染细胞。将ClonaCellTM－CHO ACF 补充剂（STEMCELL）以 3％ 的浓度添加到生长培养基中，以帮助新鲜转染的细胞恢复。在 48－72h 的恢复期后，转染的细胞在 XP CHO Growth A 选择培养基中以 3－5x105 细胞／ mL 的活细胞密度重新接种，该培养基中添加了 4 mM L－ 谷氨酰胺和 100 ug／mL ZeocinTM 试剂。随后对稳定的细胞池进行 200 ug／mL 和 300 ug／mL Zeocin 选择。
荧光辅助分选和克隆筛选
f． sight 分选前 24 – 48 小时，将稳定的池细胞以 5x105 活细 ／mL 的浓度接种在新鲜 XP CHO Growth A 选择培养基中，并加入 300 ug／mL Zeocin 。在分选当天，用 CloneSelect SingleCell Printer f． sight 分选了 60 µL 单细胞悬液，其活细胞数为 1x106 ／mL 。将按大小，圆度和平均荧光强度分类的细胞以每孔一个细胞的密度接种到预装有完全克隆培养基的标准 96 孔板（Corning 3300）中。
完全克隆培养基是不含 Zeocin 的 EX－CELL®CHO 克隆培养基（Sigma SAFC），其中添加了 4 mML－ 谷氨酰胺和 2．5％ CHO ACF 补充剂。在分选后第 0、1、2、7 和 14 天，将所有接种的孔在 CloneSelect®Imager（仅具有透射光）上成像，以验证单细胞来源的克隆。将确认的单细胞克隆依次从 96 孔板扩展到 24 孔板，6 孔板和摇瓶中，从此时起，将克隆维持在无 Zeocin 的 XP CHO Growth A 培养基中，并补充 4 mM L－ 谷氨酰胺。
蛋白质生产分析
对于细胞生长和克隆稳定性研究，每 3－4 天以 1x105 活细胞／ mL 的浓度重新接种细胞。对于所有其他摇瓶分析，将细胞以3x105 活细 ／mL 的浓度接种在 20 mL 补充 4 mM L－ 谷氨酰胺的 XP CHO Growth A 培养基中。在接种后的第三天收获条件培养基。将所有培养基样品离心以除去细胞和碎片，然后在 －80 ℃ 下保存。通过 ELISA（ab218266，Abcam）测定 tr－hIL15 蛋白效价，并在接种开始时和最终样品收集时间点测量总细胞数，以计算比生产率（SPR）。SPR 以每细胞每天产生的皮克蛋白为单位（pg 细胞－1 天 －1：pcd）计算生长速率和生产率 5 ， 这为评估和比较细胞株提供了更全面的方法。
Molecular Devices
Molecular Devices
结果
基于 EGFP 的 f． sight 荧光辅助分选法
预测克隆治疗性蛋白效价
基于报告系统的 CloneSelect Single－Cell Printer f． sight，开发了克隆选择方法以分离产生高水平治疗性蛋白质的单细胞。在该系统中，报告蛋白的表达水平用于预测每个细胞的治疗性蛋白的相对表达水平。将来自稳定转染的具有不同荧光强度的池中的细胞接种到 96 孔板中，以获得单细胞克隆，并在接种后三周通过 ELISA 测定这些克隆分泌的治疗性蛋白 （ 图 2a ）。通过CloneSelect Single－Cell Printer f． sight 以相对荧光单位 （RFU） 定量接种的每个细胞的平均荧光强度，根据细胞的 RFU 水平 （EGFP 表达水平） 将其分为四组 （A，B，C，D），与具有低 EGFP表达的 A 组相比，具有高 EGFP 表达的 B–D 组中观察到的相对 trhIL15 蛋白质表达的平均水平增加了 2．9–4．4 倍。
这表明，通过选择性分离荧光强度较高的细胞 （EGFP 表达中 － 高水平 ），我们可以去除单细胞分选阶段表达水平低的不必要细胞，并在克隆早期将资源优先分配到蛋白表达水平较高的细胞上。
图 2（A） 具有中高 EGFP 表达的 B－D 组相对蛋白表达的平均水平为 319±57．3 µg ／ L 至 477±124 µg ／ L （mean ± sem），较 EGFP 表达低的 A 组要好，高 2．9 至 4．4 倍。样本量 A：n ＝ 22；B：n ＝ 23。C：23； D：n ＝ 12。（B） 将十二个代表性克隆按比例放大到 125 mL 摇瓶中。这些克隆扩增前 3 天的蛋白产量与 96 孔板扩增前 21 天的蛋白产量呈正相关 （r＝0．89）。
为了评估细胞在 96 孔板中的蛋白质产量 （ 早期 ） 和在摇瓶中的效价 （ 后期 ） 之间的相关性，我们将 C 组的 12 个克隆扩展到摇瓶中。接种后第三天，从这些摇瓶中收获条件培养基，接种密度为每毫升 3x105 个活细胞，并通过 ELISA 定量 tr－hIL15 蛋白的表达 （ 图 2b ）。96 孔板中单细胞克隆的 21 天蛋白质产量与125 mL 摇瓶中这些克隆的 3 天蛋白质产量相关 （r ＝ 0．89） 。但是，我们无法从分类为 D 组的细胞中识别出相同的模式 （ 数据未显示 ）。D 组中具有最高 EGFP 表达和最高平均蛋白质表达水平的细胞不能很好地扩展， 十二个克隆中有四个在扩展过程中死亡。
克隆稳定性评估
在开发治疗性蛋白质时，评估克隆稳定性是细胞株开发的关键步骤。ICH Q5D guidelines6 要求生物制药厂商进行稳定性试验以确保一致的产品质量，前提是一致的细胞应产生一致的产品。对于一次生产运行，从细胞池到生产生物反应器的细胞扩增的平均时间线约为 60 代，因此克隆稳定性试验通常设计为运行相同的时间。
在这里，我们选择了克隆 2G11，这是摇瓶研究中效价最高的克隆之一，用于稳定性测试。在图 3a 中，克隆2G11 在连续传代过程中显示出稳定的细胞生长。在图 3b 中，重复测量了 SPR，从 0．201 到 0．157 （pg cell－1 day－1），在试验过程中损失了－0．044 （－22％ ）。通常，在试验过程中生产率损失（ 此处通过 SPR 测量 ） 小于 30％ 的克隆将被认为是稳定的。如图 3a－b 所示，克隆 2G11 表现出所需的特征，具有稳定的细胞生长和稳定的蛋白质产生，这表明该克隆可能是提出进一步表征的良好候选者。
图 3（A） 重复测量细胞密度和活力，每 3－4 天以 1x105 活细胞 ／ mL 的浓度重新接种到摇瓶中。（B） 比生产率 （SPR） 在从第一代细胞传代到第 19 代细胞的试验期间，以每细胞每天产生的皮克蛋白 （ pg 细胞－1day－1 ） 为单位重复测量。
结 论
本研究建立了一种高效的制备高水平治疗性蛋白重组 CHO 细胞株的方法。另外，在 96 孔板中快速选择性地筛选克隆的能力允许在克隆的早期阶段去除不需要的克隆，从而提高了过程效率。选择性筛选克隆后，具有高 EGFP 表达的克隆平均生产率提高到 0．174 pg cell－1 day－1，比未分选的亲本稳定池 （0．032 pgcell－1 day－1） 高出 5．5 倍左右。
此外，由于这种方法不依赖于所表达的治疗蛋白或报告蛋白的特异性抗体，它可以很容易地应用于任何细胞株开发过程中。
CloneSelect Single－Cell Printer f． sight
CloneSelect Single－Cell Printer 高通量单细胞分离系统使用专有的喷墨式一次性的单向分离槽，轻柔而高效地分离单个细胞。使用高分辨率的明场或荧光成像对细胞进行分离，并且每个单细胞可捕获 5 张图像。
该系统可提供单克隆性证据，提高分离效率，维持乃至提升细胞活率，并防止交叉污染。
留言可咨询产品详情哦！
参考文献：
1．h t t p s ： ／／ w w w． b u s i n e s s w i r e ． c o m ／n e w s ／ h o m e ／20191223005228／ en／Global－Therapeutic－ProteinsMarket－Report－2020－Marketwas－Valued－at－93．14－Billionin－2018－and－is－Expected－to－Grow－to－172．87－Billionthrough－2022－－－ResearchAndMarkets．com
2．Browne SM， Al－Rubeai M． Selection methods for highproducing mammalian cell lines． Trends Biotechnol． 2007 Sep；25（9）：425–32．
3．CloneTech Laboratories， Inc．； pIRES Vector Information．Protocol No． PT3266－5， Version No． PR59976， 2005
4．Davies MV， Kaufman RJ． The sequence context of the initiation codon in the encephalomyocarditis virus leader modulates efficiency of internal translation initiation． J Virol． 1992 Apr；66（4）：1924–32．
5．Brezinsky SCG， Chiang GG， Szilvasi A， et al． A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity． J Immuno Meth． 2003 Jan；277：141–155
6．ICH Q5D Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological／biological products
