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文章背景简介
BACKGROUND INTRODUCTION
CRISPR/Cas系统包括CRISPR序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和临近的Cas基因（CRISPR-associated），该系统可以精准识别并切断外源核酸，沉默外源基因的表达，保持自身遗传系统的稳定。
CRISPR序列最在是于1987年，是Ishino等人在大肠杆菌中发现。在随后的1993年相似的序列又在结核杆菌，与古盐盒菌中被发现。虽然这段重复序列在随后的十几年中，于超过40%的细菌与90%的古细菌中都被发现。但是其作用一直到2002，Jansen 等人发现了CRISPR位点相邻的基因与DNA代谢或者基因表达有关才被世人了解。另一个重大决定性发现是2005年，MoJica等人证实非重复性的CRISPR间隔区（spacer）包含外来的DNA序列，特别是噬菌体中的序列，并且一些在SCISPR位点带有病毒DNA序列的细菌可以抵抗相对细菌的感染，从而明确CRISPR/Cas系统是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒、转座子等外源遗传元件的入侵。由于CRISPR/Cas系统具有精确的靶向功能，通过简单的设计，RNA可以精准定位不同的基因靶点，可以高效率的对目标基因进行编辑和检测，因此目前该系统已被广泛用于基因编辑研究。CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier的发现，两位教授因此获得了2020年诺贝尔化学奖。
最近的研究表明，CRISPR-Cas系统可能在细菌的抗生素耐药性中发挥作用。例如有研究发现肺炎链球菌中的CRISPR-Cas系统可以阻止原生状态下的质粒转化。然而，一些研究人员通过统计模型没有发现CRISPR-Cas系统能够在细菌进化的时间尺度上阻止HGT（水平基因转移）发生的证据。先前的研究表明，CRISPR-Cas系统既可以限制肺炎克雷伯菌获得抗生素耐药性，也可以使弗朗西斯菌产生抗生素耐药性。CRISPR-Cas系统对抗生素耐药性的影响在不同的细菌中有所不同。因此，对CRISPR-Cas系统的功能及其对HGT的影响以及CRISPR-Cas与抗生素耐药性的关系的研究应该更加全面和深入。
为了研究肠球菌CRISPR-Cas系统的结构及其与MLST分型和耐药的关系，江苏大学Shuan Tao等人开展了相关研究，并于2023年4月在《Frontiers in Microbiology》杂志（IF=5.2，生物学2区）上发表了一篇名为“ Analysis of genetic structure and function of clustered regularly interspaced short palindromic repeats loci in 110 Enterococcus strains”的文章。
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所用到的主要方法
METHODS
1. Crispr-Cas Finder寻找CRISPR和Cas基因
2. CRISPR序列及重复序列的RNA二级结构分析
3. 间隔序列同源性分析
4. 前导序列的预测与分析
5. 肠球菌的MLST基因分型
6. 肠球菌全基因组耐药基因的筛选
7.统计学分析
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文章主要内容摘要
ABSTRACT
聚集规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其CRISPR相关蛋白(Cas)是一种适应性免疫系统，参与特异性防御外来遗传物质(如质粒和噬菌体)的入侵。该研究旨在分析基因结构，探讨CRISPR系统在肠球菌基因组中的功能，特别是在耐药方面的功能。从NCBI数据库中下载110株肠球菌的全基因组信息，采用生物信息学方法分析CRISPR-Cas系统的分布和结构，包括Cas基因、重复序列和间隔序列，并寻找耐药相关基因并分析其与CRISPR-Cas系统的关系。使用多位点序列分型(MLST)数据库进行肠球菌多位点序列分型。从CARD数据库中检索肠球菌耐药信息，统计分析耐药性与CRISPR之间的关系。110株肠球菌中，39株(35.45%)含有完整的CRISPR-Cas系统，共鉴定出CRISPR阵列87个，62株含有Cas基因簇。肠球菌基因组中的CRISPR系统以II-A型为主(59.68%)，其次是II-C型(33.87%)。cas1基因序列的系统发育分析与CRISPR-Cas系统的分型基本一致。在纳入MLST分型研究的74株菌株中，只有19株(25.68%)与CRISPR- Cas分型相关，而MLST分型的大多数菌株(74.32%)与未分型的CRISPR系统相关。另外，CRISPR-Cas系统可能只与部分耐药基因的携带率和耐药表型有关。综上所述，肠球菌CRISPR- Cas系统在不同物种间的分布差异较大，CRISPR位点的存在减少了部分耐药基因的水平转移。
简言之，本文的主要研究内容有：
1.肠球菌CRISPR-Cas系统的分型
2.肠球菌MLST分型
3.肠球菌耐药基因的筛选
4.相关性分析
