多光子显微（Multiphoton Microscopy, MPM）成像是一种非侵入、无标记成像技术。利用来自不同模态的非线性信号，多模态MPM可以提供代表不同组织结构的互补信息。本文研究展示了一种具有深度扫描的多模态MPM系统[1]。
图1 多模式MPM成像系统[1]
实验装置中的激发光源采用中心波长位于1580 nm的锁模掺铒光纤激光器，脉宽约80 fs。作者利用PPLN晶体通过二倍频，获得了中心波长为790 nm的飞秒脉冲，转化效率约为35%。790 nm飞秒脉冲可用于激发TPEF（two-photon excitation fluorescence, TPEF）和SHG（second harmonic generation, SHG）信号，而1580 nm飞秒脉冲可用于激发THG（third harmonic generation，THG）信号。作者采用MEMS反射镜实现XY平面扫描，采用形状记忆合金(shape-memory-alloy, SMA)驱动的物镜实现Z方向的深度分辨扫描，深度扫描范围为~370 μm。图2展示了SMA驱动物镜单元的工程设计和组装，这里的SMA具有低成本、扫描范围大、响应快等优势。
图2 SMA驱动物镜组的构造[1]
与双光子成像相比，三光子非线性效应的效率低得多，因此THG信号在大多数动物组织中尤其微弱，作者通过图像自定义去噪算法来提高图像对比度。图3比较了处理前、ImageJ异常值去除去噪处理后和自定义去噪算法处理后的超低信噪比图像。通过图3可以看出，本文作者采用的算法能够有效增强弱通道的对比度，提高组织结构的可视化。
图3 去噪前后的THG图像[1]
为了证明该多模态MPM的成像与深度扫描能力，作者对各种动物组织样本和植物样本成像。作者通过SMA驱动物镜获取步长为4 µm的图像堆栈，在软组织中的穿透深度为250 µm，骨组织中的穿透深度约为150 µm。由于激发波长不同，双光子和三光子原始图像之间的焦点偏移约为80 µm，在合并通道时需要校正。图4展示了从不同深度的动物组织获得的图像，来自三个通道的互补信息区分了内部的各种结构和物质，可以看到皮肤组织和骨组织上的不同层结构。
图4 来自不同深度动物组织的多模式MPM图像[1]
图5显示了从真菌和植物组织中获得的图像。与具有丰富胶原纤维的动物组织不同，从真菌和植物组织中只能获得非常弱的SHG信号。
图5 来自不同深度的真菌和植物组织样本的多模式MPM图像[1]
在本研究中，作者开发并演示了一种基于掺铒光纤激光器的紧凑型多模态MPM系统，分别为三光子和双光子成像提供1580 nm和790 nm的激发波长，并通过SMA驱动的物镜实现深度分辨扫描。这种具有深度扫描物镜的微型多模态MPM在未来临床的内窥镜设计中显示出巨大的潜力。
参考文献：
[1]Wentao W ,Qihao L ,Christoph B , et al.Dual-wavelength multimodal multiphoton microscope with SMA-based depth scanning.[J].Biomedical optics express,2022,13(5):2754-2771.
