数十亿神经元之间相互作用，使大脑呈现出复杂的形态。研究这样一个复杂系统依赖于多色荧光成像和各种生物标志物，具有三种以上颜色的同时多色标记已经越来越多地用于大脑研究。例如，Brainbow是一种基于三个或四个荧光蛋白（FP）的多色标记技术，用于绘制神经元的连通性。
最初，波长可调钛宝石（Ti：S）飞秒振荡器经常被用来依次激发多个荧光标记。但是在波长调谐和重复扫描期间，较长的扫描时间可能会导致样品不稳定，顺序激发会使成像速度变慢。因此，迫切需要开发一种能够同时为双光子荧光显微镜（TPFM）提供多种激发波长的光源。
现有的同时多色激发源只能通过非线性光学或光纤技术提供三个激发波长。最早是通过钛宝石激光同步泵浦OPO获得双波长，再加上双波长的和频来产生第三个虚拟激发波长［1］，实现三个FP的Brainbow成像。为了解决基于固体激光器的系统尺寸和成本问题，目前有通过倍频高能掺铒光纤激光器出射的脉冲再加上使用大模场光子晶体光纤（PCF）红移脉冲来获得三波长［2］，以及通过高非线性PCF实现孤子自频移来产生三波长［3］，但没有较好的方式产生同时四波长的激光源。在Brainbow系列中具有最广泛的双光子吸收范围，并且广泛适用于各种组织和物种的腺相关病毒的4－XFP Brainbow （Brainbow AAV），需要同时激发四个荧光团，在 TPFM 中对应于蓝色TagBFP、青色mTFP、黄色EYFP 和红色mCherry，峰值分别位于810、870、970和1080 nm。因此，需要开发一个四波长的激发源。
2021年孙等人提出了用于TPFM的飞秒四波长激发源［4］。使用1，070 nm掺镱光纤飞秒激光器泵浦高非线性PCF（HNPCF），在弱负色散区域中的自相位调制（SPM）效应使光谱蓝移，左侧产生两个光谱峰，中心波长分别在812和960 nm。通过将蓝移的光谱压缩到33 fs以确保812和960 nm这两个峰在时间上重叠，和频效应（SFG）会在886 nm 处产生第三个虚拟激发波长，结合1070 nm 的泵浦波长，该激发源一共能提供四个波长。
图1为四波长激发源的实验装置。掺镱光纤激光器发射48 fs的脉冲，中心波长为1070 nm，重复频率为70 MHz。通过使用非球面透镜和手动三轴载物台将该脉冲耦合到零色散波长为1040 nm的6．5 mm长的HNPCF中来实现光谱蓝移。然后通过半波片和偏振分束器进行功率调节来优化波长转换。进一步使用带通滤波器（BPF）从HNPCF的输出中选择750–1000 nm的波长范围。滤出来的脉冲和1070 nm的脉冲分别由光栅对（图1（b））和棱镜对（图1（c））预啁啾，然后通过双色镜组合。HNPCF 输出脉冲包括812、886和960 nm，与1070 nm的泵浦脉冲结合来实现TPFM中的同时四色激发。
图1 四波长激发源的实验装置。HWP：半波片；PBS：偏振分束器；L：透镜；BPF：带通滤波器；PPC：棱镜对；GPC：光栅对；SDM：短通双色镜。
图2为不同长度的HNPCF得到的输出光谱，红色虚线框显示了通过BPF滤波的光谱范围。从图中可以看出通过缩短光纤能增加转换波长的功率，当HNPCF长度为6．5 mm时，泵浦功率为1179 mW，滤波后的功率为336 mW。此时光谱有两个峰值，分别为812 nm和960 nm，对应于TagBFP的双光子吸收峰值和EYFP的双光子吸收峰值。进一步通过812 和960 nm的时间重叠产生886 nm的虚拟激发波长，来激发mTFP。
图2 不同长度的HNPCF得到的输出光谱
最后，使用33 fs的蓝移三波长脉冲和73 fs的1070 nm脉冲对4－XFP标记、80 µm厚的表达TagBFP、mTFP、EYFP和 mCherry的小鼠脑切片进行成像。图3（a）－（f）和（g）－（l）分别是在小鼠脑切片的两个不同深度（20和34 µm）同一位置处获得的图像，显示了 mCherry（图3（a）和（g））、EYFP（图3（b）和（h））、mTFP（图3（c）和（i））和 TagBFP（图3（d）和（j））的荧光图像，以及叠加四种荧光图像产生的4－XFP Brainbow AAV的图像（图3（e）和（k））。
图3 4－XFP Brainbow AAV标记的小鼠大脑皮层切片的双光子荧光图像
总之，该课题组提出了一个基于飞秒掺镱光纤激光的四波长激发源，能在TPFM中进行同时高效的四色成像。
参考文献：
［1］ P． Mahou， M． Zimmerley， K． Loulier， K． S． Matho， G． Labroille， X． Morin， W． Supatto， J． Livet， D． Débarre， and E．Beaurepaire， “Multicolor two－photon tissue imaging by wavelength mixing，” Nat． Methods 9（8）， 815–818 （2012）．
［2］ K． Wang， T．－M． Liu， J． Wu， N． G． Horton， C． P． Lin， and C． Xu， “Three－color femtosecond source for simultaneous excitation of three fluorescent proteins in two－photon fluorescence microscopy，” Biomed． Opt． Express 3（9），1972–1977 （2012）．
［3］ K．－C． Li， L． L． Huang， J．－H． Liang， and M．－C． Chan， “Simple approach to three－color two－photon microscopy by a fiber－optic wavelength convertor，” Biomed． Opt． Express 7（11）， 4803–4815 （2016）．
［4］ T．－H． Yang， F．－H． Yu， B． J． Borah， S．－K． chen， and C．－K． Sun， “Single－laser－based simultaneousfour－wavelength excitation source for femtosecond two－photon fluorescence microscopy，” Biomed． Opt． Express 12 （8）， 4661－ 4679 （2021）.
