多光子显微镜可以在亚细胞分辨率下对生物组织进行无标记三维成像，利用近红外波段的驱动光源让组织中的成像深度更深，且不易造成光损伤，这些优势使得多光子显微成像成为深脑研究的有力工具。本期介绍用于深脑成像的小型化多光子显微镜。
文献一发展了一种三光子深脑成像显微镜系统，优势在于可以更高效率地收集弹道区以外的信号光，进而增加成像深度。三光子显微成像的激发光波段一般在1300nm附近，信号光为520nm左右的绿光，其在灰质和白质中的平均自由程分别是75um和25um，而灰质和白质本身的深度约为700um和150um，因此大脑皮层大部分区域的深度和平均自由程的比值都大于10，不属于弹道光子，信号杂散不易收集。在脑科学研究中，需要测量实验对象在自由活动情况下神经元对于某种刺激的反应，因而系统要尽可能小且轻。
系统的头戴部分光路如图1，其中物镜为一个简化的无限远焦微型物镜(SIMO)，透镜更少，长度更短，表面更平坦，可以更有效收集散射信号光。阿贝聚光镜将散射光聚集进入柔性纤维束(fiber bundle)，激发端用了李斯特透镜作为管镜，由于阿贝聚光镜与李斯特透镜共用其中一组透镜，且用于区分激发光和信号光的双色镜放在透镜组之间，可以进一步压缩头戴部分的光路。光束的横向扫描通过MEMs完成。最终的小型化三光子m3PM系统的头戴部分重2.17 g，尺寸为2 × 1.6 × 0.9 cm3。
图1 m3PM头戴部分光路图[1]
使用400 nm荧光珠测定了水及硅油视野中心的横向分辨率约为0.97um，轴向分辨率约为7.2μm,接近理论上的衍射极限。又测试了视野边缘的分辨率，220×220um2及400×400um2视野边角的四个点在水中的分辨率均有所下降，轴向下降更明显。
图2 m3PM系统分辨率测试 [1]
实验对固定头部和自由活动的大鼠都进行了成像。在头部固定实验中，对PPC贯穿皮层直到表层下970um的区域都进行了三光子、三倍频成像，见图3a。不同深度的单个神经元钙活性瞬态变化呈现高度异质性，见图3b。几毫瓦的激光功率足以对白质胼胝体CC以上所有层成像，而对接近海马体CA1区域的皮层下（大概在908um） 区域需要24.7 mW。白质以下，距离表层1.2 mm深度成像所需激光功率为51.5 mW，约为损伤阈值的一半。自由活动中的成像结果见图3f，依然可以进行清晰的深度成像。在持续观察20min内幅度、衰减时间以及信噪比均无明显变化，见图3h，说明头戴系统对小鼠自由活动无影响。
图3 m3PM系统脑成像实验结果[1]
第二篇文章中的小型化系统（图4a,b）通过离焦来获得不同深度的图像，通过调整输入端光纤端面与准直透镜之间的距离调整成像深度（图4a,c），在操作过程中需要考虑可调节距离与轴向分辨率之间的折衷平衡（图4e）。激发光由光子晶体光纤传输，经准直透镜准直后进入头戴部分光路，MEMs负责完成光束的横向扫描，再经由一组中继透镜填充物镜后孔径。物镜聚焦激发光到生物组织特定深度并收集产生的信号光，两者通过双色镜分光，信号光最终进入集成在头戴装置上的硅光电倍增管。图4f为从皮层1到CC的三光子（有GCaMP7f标记）及三倍频成像结果，图4g为特定深度处的平面图。
图4 离焦调焦小型化MPM系统[2]
为了量化佩戴显微镜对动物行为和活动的影响，实验组比较了不戴任何东西的小鼠和佩戴显微镜的小鼠活动中行进的速度，有无显微镜的小鼠测出的中位速度无显著差异。为了量化显微镜对头部朝向的影响，还进行了对同一只小鼠三天内运动轨迹的记录，佩戴前后也无显著差异。
图5 头戴显微镜对小鼠活动影响实验[2]
总而言之，小型化多光子显微镜系统是生物医学研究中进行深脑成像及神经元活动监测的有力工具，是多光子显微成像领域中一个极具潜力的前沿方向。
参考文献：
