荧光显微镜是生物成像中十分重要的工具。传统的荧光扫描显微镜通过点扫描的方式获取一个平面的图像，可能有光漂白和光损伤的风险，本文介绍的光片荧光显微镜通过一片光依次照亮样品中的平面来提供体积成像可以避免上述风险，具体过程如图1所示：显微镜使用一层光片从样品侧面激发荧光样品，通过CCD来检测成像，而入射照明光路和CCD接收光路互相垂直。激发光片从侧面入射到样品上，通过移动样品可使入射光激发不同的平面，且光片的角度可以改变，这样就可以很容易的得到整个组织的三维图像，同时保证细胞水平的分辨率。由于样品受激发的平面就是成像平面，所以可以将光漂白和光学损伤降到最低。
图1：光片荧光显微镜。（a） 光片显微镜原型：成对的正交光路提供平面照明（蓝色）和宽视场荧光检测（绿色）。（b） 通过选择性照射单个平面进行光学切片。
图2展示了几种光片显微镜的基础类型，结构最简单的选择性平面照明显微镜（SPIM），缺点是有伪影，对比度低，它的变体多向选择性平面照明显微镜（mSPIM）可以解决伪影问题，但对比度比较差。数字扫描光片显微镜（DSLM）通过线扫描产生的虚拟光片可解决对比度较低的问题，此外还有多向数字扫描光片显微镜（mDSLM），通过结合mSPIM和DSLM同时解决了伪影和低对比度这两个问题。
图2：SPIM 同时照亮和捕获来自整个视场的荧光，而 mSPIM 通过围绕其中心旋转光片来减少条纹伪影。DSLM 通过线扫描产生虚拟光片，在任何给定时间仅激发并收集当前照明条带发出的荧光。
该综述［1］汇总了大量设计和优化光片荧光显微镜的方法，依次介绍了光片荧光显微镜如何获得高分辨率，提高在深度的穿透能力，以及实现多视角超快速成像。
实现高分辨率成像的第一个挑战是物镜的尺寸问题。卓越的轴向（横向）分辨率需要高数值孔径（NA）的激发（收集）物镜，而高NA的物镜普遍工作距离短，体积庞大。两镜头正交放置，彼此在空间上势必受到约束。为克服这一限制，一种常见的思路是使用相对垂直方向 45° 放置的镜片将薄光片导向检测平面（图 3）。这不仅允许系统使用超高NA的检测物镜，还提供了额外的好处，因为倒置成像几何结构有助于围绕传统显微镜主体进行构建。
图3：反射式光片 （a） 反射式SPIM——光片从激发物镜发射，反射至检测目标。（b） 单物镜——光片直接从检测物镜端发射。
高分辨率成像的第二个挑战是如何在大视场下保证各向同性的轴向分辨率。由于高 NA的高斯光片在远离焦点后会迅速发散，因此出现了许多使用非衍射光束模式解决这个问题的方法，最常见的是贝塞尔光束，如图4所示，其横截面由一个狭窄的中心组成，周围环绕着一系列强度递减的环。利用贝塞尔光束扫描能在跨越40 μm的视场下提供近300 nm的各向同性分辨率，但其光束的旁瓣会照亮离焦区域，进而降低成像的对比度。而通过与结构光照明或多光子激发技术相结合，可以消除或抑制这些图像中的离焦贡献。除此之外，也可以放弃复杂的光束整形方案，通过高速轴向扫描高斯光束来同时实现高分辨率与大视场，其中的代表是轴向扫描光片显微镜（ASLM）。
图4：产生等效长度光片的高斯（a）与贝塞尔（b）光束。
多视图成像也是增强分辨率的一种常见策略。如图5所示，沿样品正交方向成像，从而获得样品的两个正交视图，以及显微镜的各向异性点扩散函数 （PSF）。每个单独的视图都受到沿不同维度的低分辨率的限制，但与多视图解卷积相结合后就会产生所有维度的高分辨率图像，这被称为双视图平面照明（diSPIM），这种方法对于小而透明的样品非常有效，并且已经在体积高达80 × 80 × 50 µm3的情况下得到了证明。
图5：多视图分辨率增强的原理示意图。
光片荧光显微镜的穿透能力与激发光束的波长密切相关。由于更长的波长散射更弱，光片能在更大的距离内不受干扰的传播，利用红外波段多光子激发荧光是提高光片显微镜成像深度的直接方案。如图6所示，单光子激发光束，组织散射严重，随着光束的传播，每单位体积的信号线性衰减。而使用双光子激发，散射大幅减少，且随着光束的传播，信号呈二次衰减。这说明双光子激发的光片显微镜不仅穿透力更强，也可通过限制散射光子的荧光贡献来提高成像对比度。需要注意的是，多光子光片显微镜依然有非线性过程导致的光损伤问题，且十分依赖于前端超快激光器的发展。
图6：假想的未散射光束（a），单光子激发光束（b）， 双光子激发光束（c）， 在组织中的传播示意图。
高成像速率是光片显微镜的天然优势。光片荧光显微镜通常具有每秒数百帧的平面成像速率，因此，通过扫描光片，数赫兹的体成像速率是完全可行的。然而，在光片显微镜的结构中，样品和物镜都不方便快速移动，而收集物镜的焦面又需要紧跟扫描的光片，这就对收集物镜的景深提出了很高的要求。如图7所示，有三种常见的提高物镜景深的方案：①使用电可调谐透镜（ETL），时刻改变焦距，保持焦面与光片同步扫描。②利用波前编码技术，令不同位置的光片在物镜出瞳处呈现特定的几何形状，从而变相拓展了景深。③通过分层折射率介质静态拓展景深。除此之外，还可以采用基于倾斜照明及探测方案的单物镜光学系统，规避焦深的问题。
图7：超快速体成像方案。（a） 利用电可调透镜动态拓展景深。（b） 利用波前编码来静态拓展景深。（c） 球面像差辅助显微镜 （d） 使用基于倾斜照明和探测方案的单物镜光学系统。
总结来说，光片荧光显微镜是一种重要的光学成像技术，且已较为成熟。随着时间的推移，我们相信它将不断取代更为传统的技术，以满足对细胞、组织、乃至整个生物体快速成像的需求。
参考文献：
［1］ Rory M Power， Jan Huisken． A guide to light－sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging． Nat． Methods 14， 360–373 （2017）．
