苏木精-伊红(H&E)染色是病理检测组织和疾病(如癌症)异常的金标准工具。但H&E染色繁琐耗时，用于术中诊断会延误和浪费宝贵的时间。近些年发展的实时无标记成像技术，如同步无标记自发荧光多倍频(SLAM)显微镜技术，能在很短的成像时间内提供更多层面的信息来高精度地表征组织。但是这类无标记成像技术仍未转化到临床，缺乏对成像新技术和标准H&E白光成像的精准对比。本篇文章提出了一种工作流程，可以对SLAM显微镜和石蜡包埋的H&E组织学进行精密的比较和关联[1]。整体流程是首先用SLAM显微镜对样品成像，然后处理组织并H&E染色，最后对染色的载玻片实施白光成像。由于样品通常体积庞大（数十毫米立方体），但是H&E组织学需要观察非常薄的切片，因此必须精确协调SLAM成像和标准H&E白光成像，才能在两种方法中实现相同的视场。除了匹配x、y和z中的坐标外，偏航角和俯仰角也必须匹配，而H&E样品需要固定等处理并嵌入石蜡中，这使其很难完全匹配SLAM显微镜的图像。
图1 精密匹配无标记SLAM图像与H&E染色组织切片图像的工作流程[1]
作者针对上述难点提出了以下的方法和工作流程：1）减小尺寸，2）添加参考平面，3）用激光在组织表面打上标记，以及4）切片机与参考平面的激光对准。图1显示了整个工作流程，首先新鲜切除的组织标本被包埋在琼脂糖凝胶中，随后使用振动切片机将组织预先切片成 200-500 微米范围内的较薄切片（方法1）。然后将切片夹在盖玻片和载玻片之间。其中由于盖玻片保持与SLAM成像平面平行，作为参考平面，并在整个过程中保持不变（方法2）。进一步将组装好的组织切片在SLAM显微镜上成像。对于没有明显特征的样品会通过激光在组织上留下标记，以便能够跟踪SLAM和H&E之间的相同位置（方法3）。SLAM成像后，将组织和盖玻片放置在组织处理盒中完成福尔马林固定和石蜡包埋。接着将石蜡包埋的组织放入切片机中，使用激光对准系统校正俯仰和偏航，以确保切片机的切片平面与成像平面相匹配（图2，方法4）。最后，将石蜡包埋的组织切成5μm切片并脱蜡染色。遵循这些流程就可以使新鲜组织的无标记SLAM图像与H&E染色组织切片的图像精密匹配。
图2 激光对准的切片机系统。激光对准过程包括两个步骤：1) 利用石蜡块表面的反射使激光与刀片垂直；2) 利用盖玻片表面的反射使样品与激光垂直[1]
总之，该文献提出了一种工作流程可以将传统组织病理学成像与现代非线性光学成像(SLAM显微镜)高精度匹配。尽管由于新鲜样品和加工样品的过程中都会发生复杂的组织形变，两种成像模式之间的比较在微米尺度上并不完全是一对一的，这种工作流程仍然保留了丰富的相关信息，可供病理医生参考，以增强甚至取代目前的组织病理学技术。
参考文献：
[1] K. F. Tehrani, J. Park, E. J. Chaney, H. Tu and S. A. Boppart, "Nonlinear Imaging Histopathology: A Pipeline to Correlate Gold-Standard Hematoxylin and Eosin Staining With Modern Nonlinear Microscopy," in IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, vol. 29, no. 4: Biophotonics, pp. 1-8, July-Aug. 2023, Art no. 6800608, doi: 10.1109/JSTQE.2022.3233523.
