今天给大家分享的是一篇2＋分的学习笔记。这篇学习笔记通过差异表达基因（DEGs）筛选、加权共表达网络分析（WGCNA）、GO和KEGG富集分析、PPI网络分析确定枢纽基因、验证枢纽基因，最后筛选出相关小分子药物。通过一系列的分析，最终找到了20个枢纽基因，并发现了在幼年型皮肌炎（JDM）中起关键作用的基因功能。
题目：使用共表达网络分析（WGCNA）揭示线粒体功能障碍和干扰素特征在幼年型皮肌炎（JDM）中的关键作用
一、研究背景
幼年型皮肌炎（JDM）是一种罕见的慢性儿童发病的自身免疫性疾病，其特点是皮肤和肌肉内的小血管和组织发生炎症浸润。JDM的病因尚未明确，有研究表明遗传和环境因素在其发病过程中发挥着重要的作用。加权基因共表达网络分析（WGCNA）算法是一种强大的生物信息学方法，利用WGCNA对JDM肌肉样本的病理状态和基因表达数据进行分析，探索和验证与JDM相关的枢纽基因，并预测治疗JDM的小分子药物，前景广阔。
二、分析流程
三、结果解读
1． 筛选差异表达基因（DEGs）
使用R软件包Limma从训练数据集GSE3307（39个肌肉活检样本，包括21个JDM患者和18个健康对照）中挑选出2834个差异表达基因，包括1888个下调基因和946个上调基因。筛选标准为假阳性率（FDR）＜0．05和｜log2fold change｜＞1。
2． 构建共表达网络（WGCNA）
直接使用GSE3307中方差排前25％的5103个基因进行WGCNA构建。为确保无标度网络的无标度R2等于0．90（代表该模型的预测准确度高），选择的软阈值等于10。最终得到了13个模块（图1和图2）。
图1． 基因谱系图（红线以下为有效的模型）
图2． 基因的聚类树图（每一种颜色代表一个模块）
对于这些模块进行了以下分析，结果是：
利用网络热图分析了12个模块的交互关系，所有模块的划分与作者的分析高度独立。
图3． 基因的网络热图
模块特征基因树状图和相邻关系热图显示12个模块被分为两个簇（图4）。
图4． 模块特征基因树状图和相邻关系热图
根据相关系数＞0．80、P值＜0．05的标准，确定蓝色、浅绿色和午夜蓝色模块为关键模块（对应图中第一列第1行、第8行和第9行）（图5）。
图5． 模块－特征关系的热图
对关键模块进行后续分析，以确定关键模块与具有实质性生物学意义的JDM病理状态之间的相关性（图6）。可以从图中发现三大模块的相关性均在0．80以上，p值均小于0．05。
图6． 三个关键模块和JDM基因之间的散点图
3． GO和KEGG富集分析
对关键模块中的所有基因进行GO和KEGG通路富集，挖掘与JDM相关的生物学功能。（图7）
GO分析的生物学过程（BP）显示（图7A）：
蓝色模块中的基因与SRP依赖的共译蛋白靶向膜的产生、共译蛋白靶向膜、蛋白靶向ER、核转录mRNA分解过程和蛋白定位到内质网的建立有关；
浅绿色模块中的基因与I型干扰素的响应、I型干扰素信号通路、细胞对I型干扰素的响应、对病毒的防御响应和对病毒的响应有关。
午夜蓝模块中的基因与细胞对化学刺激的反应、细胞外结构组织、细胞外基质组织、对有机物的反应和细胞运动性有关。
CC（细胞成分）和MF（分子功能）在三个关键模块中的路径富集结果也可在图中得出，在此不一一赘述（图7B＆C）。
三个模块中KEGG通路富集分析结果也在图中可以看到（图7D）。
图7． GO分析结果和KEGG富集分析结果
4． 借助PPI网络筛选关键基因和关键模块
筛选出关键模块连接读较高的45个DEG作为候选的枢纽基因，然后根据STRING数据库构建PPI网络，在构建PPI网络的过程中，使用MCODE得分＞0的标准，选出了28个枢纽基因并构建了网络（图8）。（图中不同的形状代表了通过分子复合物检测（MCODE）构建的不同簇，即椭圆代表簇1，三角形代表簇2；颜色由深褐色到浅褐色的变化表示MCODE得分由高到低的变化）
图8． 45个枢纽基因的PPI网络
接着使用另一个GEO数据库（GSE11971）的JDM数据进行验证。最后发现：
SP110、SAMHD1、IFIT5、PLSCR1、IFI16、MX2和CLIC1等7个基因在JDM中显著上调；
COX5B、COX6A2、COX7C、NDUFA4、NDUFB4、MDH2、ATP5O、ATP5B、RPL21、TPI1、SLC25A3、VDAC1和EIF4B等13个基因在JDM中显著下调。
此外这篇学习笔记还给出了枢纽基因在JDM发病过程中的机制图（图9）
图9． 枢纽基因在JDM发病过程中的机制图
5． 相关小分子药物筛选
利用CMap数据库（一个化学试剂作用表达谱数据库，研究者可以通过自己做出的疾病表达谱或化学物质刺激后的表达谱所获得差异表达基因，通过在cMap中的查询，可以获得类似表达药物或者相反表达药物）进行小分子药物筛选。筛选标准为p＜0．05，从而确定了12种小分子药物（表1）：
阿卡西汀、头孢糖苷、lanatoside C、去氧胺、法莫宗、他尼霉素和LY－294002可以减缓JDM的发展；
贝托尼、非洛地平、丙戊酸和西罗莫司可能为JDM提供潜在的治疗目标。
表1． 筛选得到的12种小分子药物
小结
这篇学习笔记利用GEO数据库，使用WGCNA进行模块分析，之后对得到的关键模块的基因进行GO和KEGG富集分析，得到与关键模块有关的生物学过程，细胞成分和分子功能；然后将筛选得到的差异表达基因进行PPI网络分析得到枢纽基因，并通过另一个GEO数据集对枢纽基因进行筛选得到20个真正的枢纽基因；最后通过得到的基因筛选得到与JDM有关的小分子化合物，从而确定了治疗靶点和治疗抑制剂。
