目前，使用PD－1／PD－L1抗体的免疫检查点阻断（ICB）治疗已证明对多种癌症有效，但是对ICB治疗具有响应的患者只占到了20－30％。最近的研究表明，具有高肿瘤内CD8＋T细胞浸润的患者对ICB有更好的反应。为了提高免疫治疗的疗效，必须促进细胞毒性CD8＋T细胞的肿瘤内迁移。然而，调节CD8＋T细胞肿瘤浸润的分子机制尚不清楚。
外泌体是由细胞分泌的胞外囊泡（sEV），可能影响细胞间的通讯，其中外泌体中负载的异质性是外泌体多种功能的基础。阐明货物分拣到外泌体的机制是理解外泌体异质性及其功能的关键。转运必需内体分选复合物（ESCRT）系统在外泌体发生过程中起着重要作用。HRS（肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物）是ESCRT的关键组成部分，它介导初始负载识别和分选到多囊泡内体（MVE），然后将其输送到质膜进行外泌体分泌。
最近的研究发现，在细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化后，HRS在空间上阻止了CD8＋T细胞浸润到黑色素瘤组织中。在机制上，磷酸化HRS与PD－L1发生强烈相互作用，并选择性地促进PD－L1负载到外泌体，从而阻断CD8＋T细胞浸润。在各种小鼠模型中，组成性磷酸化HRS的表达导致对抗PD－1治疗的抵抗，而抑制HRS磷酸化可增强PD－1阻断的治疗效果。因此，抑制HRS磷酸化可能作为增强ICB治疗的潜在策略。
ERK对HRS的磷酸化限制了CD8＋T细胞向肿瘤的浸润
使用特异性针对HRS磷酸化的抗体，能够在细胞中检测到磷酸化HRS。使用该抗体，在黑色素瘤患者样本的组织中检测HRS的磷酸化和CD8＋T细胞的分布。结果显示，与低HRS磷酸化的肿瘤相比，高HRS磷酸化的肿瘤中的CD8＋TIL水平较低。原发性黑色素瘤中CD8＋TIL的数量与HRS磷酸化水平呈负相关（R＝−0．4060； P＜0．001）。
HRS磷酸化抑制TIL并诱导抗PD－1治疗的耐药性
CD8＋T细胞浸润与抗肿瘤免疫有关。为了研究肿瘤细胞中的HRS磷酸化是否参与免疫抑制，研究建立了稳定的YUMMER1．7细胞系，表达野生型（“HRSWT”）、磷酸化缺陷型（“HRSS345A”）和磷酸化突变型（“HRSS345D”）。
随后在C57BL／6小鼠中，研究了HRS磷酸化是否影响YUMMER1．7肿瘤的PD－1阻断治疗。结果显示，抗PD－1抗体有效抑制表达HRSS345A肿瘤的生长，而PD－1阻断的抑制作用在HRSWT肿瘤中降低，在HRSS345D肿瘤中几乎消失。这些结果表明，由HRS磷酸化诱导的免疫抑制阻碍了PD－1阻断性抗体的效果，因此，抑制HRS磷酸化可能增强PD－1阻断剂的治疗效果。
HRS磷酸化导致PD－L1在外泌体中选择性富集
接下来，研究了HRS磷酸化调节T细胞浸润的机制。HRS是ESCRT复合物的关键组成部分，它介导PD－L1向MVE的富集，PD－L1可以从MVE转移到溶酶体进行降解，这对PD－L1表面表达至关重要；也可以作为PD－L1外泌体分泌到细胞外，有助于肿瘤的免疫抑制作用。
通过对不同HRS磷酸化水平的细胞进行荧光染色，可以发现，PD－L1水平在HRS磷酸化高水平的HRSS345D细胞分泌的EVs中增加。此外，免疫沉淀研究表明，PD－L1与HRSS345D有强相互作用，而这种相互作用在S345A突变型中减弱。
这些结果表明，ERK介导的HRS磷酸化促进PD－L1向MVE的募集并以外泌体分泌。
HRS磷酸化的sEV有效抑制CD8＋T细胞浸润
输注来自B16F10细胞表达PD－L1的sEVWT或sEVS345D可显著促进小鼠模型中的PD－L1－KO B16F10肿瘤生长，在Rag2−／−小鼠的肿瘤中没有观察到这种作用。sEVWT和sEVS345D抑制了CD8＋T细胞向PD－L1－KO B16F10肿瘤的浸润，这与表达不同HRS突变体肿瘤中的CD8＋TIL分析一致。
小结
肿瘤浸润的细胞毒性T细胞与患者对ICB的反应密切相关。为了制定有效的新策略来改善患者响应，了解T细胞肿瘤浸润的分子机制至关重要。最新的研究表明，HRS的磷酸化对于CD8＋T细胞的肿瘤浸润至关重要，并且这种作用主要由表达PD－L1的外泌体介导。HRS磷酸化在抗PD－1治疗的耐药性中起着至关重要的作用。开发针对HRS磷酸化的小分子药物可能会提高PD－1阻断剂的疗效。
