大家好，今天要和大家分享的是今年二月份发表在Cancer Cell （IF：26．602）上的一篇文章，“An Integrated Gene Expression Landscape Profiling Approach to Identify Lung Tumor Endothelial Cell Heterogeneity and Angiogenic Candidates”，作者使用单细胞RNA测序研究了人类和小鼠非小细胞肺癌的肿瘤内皮细胞（TEC）表型，探究了不同表型之间的功能以及跨物种的保守性，发现特定的TEC表型与抗血管生成治疗的预后和反应有关，并通过实验验证了特定的抗血管生成物与保守的TEC表型关系。
An Integrated Gene Expression Landscape Profiling Approach to Identify Lung Tumor Endothelial Cell Heterogeneity and Angiogenic Candidates
通过整合基因组分析以鉴定肺肿瘤内皮细胞异质性和血管生成候选物
一、文章背景
在视网膜血管化模型的血管芽生过程中，内皮细胞（EC）的发育存在异质性：tip EC导引血管出芽，而stalks EC的增生则延长了血管。tip EC和stalks EC并非预先由基因决定，而是可动态互换的表型。
在患者，物种间和模型间的单细胞水平上肿瘤EC（TEC）的转录组异质性尚未在单项研究中分析进行盘点。
在肿瘤血管生成领域，一些单细胞RNA测序（scRNA－seq）研究汇总了先前已知的TEC表型进行描述，但并没有研究确定这些亚型与经过功能验证的血管生成候选物之间的关联性。与此同时，有人质疑一种肿瘤类型的单个scRNA－seq研究是否足够去探究确定血管生成候选物，因为在一项研究中，在2种人类结肠癌异种移植模型中的tip EC表达了不同的标志物。
作者希望克服物种和模型相关的变异性，使用了scRNA－seq，以及正交多组学方法进行验证，以识别患者，肿瘤类型，物种、个体和模型之间的保守表型和标记模型，以探究亚型与血管生成相关的标志物功能与保守型以及可能存在的预后相关性。
二、文章思路
人类肺癌中EC
常用model中EC
保守表型及标志物鉴定＆靶标筛选
三、结果解读1．人类肺癌中EC表型的单细胞图谱
作者主要针对人类非小细胞肺癌（NSCLC）进行研究：
对来自1个大细胞癌患者，4个鳞状细胞癌患者和3例初治腺癌的新鲜分离的人类肿瘤EC（hTEC）和配对（样本来源患者）的人类腹膜外非肿瘤性肺EC（human pulmonary EC－hPNEC）进行了分析。
附表1：研究中提供样本的患者的基线特征
作者对单细胞悬液使用磁性激活细胞分选（MACS） EC（图1A），并使用10X scRNA－seq。在对检测到的基因数量和线粒体读数进行质量过滤后，评估重复数据，并根据文库大小对转录本读数进行标准化（STAR方法）。
筛选出测序细胞中的EC（图S1A和S1B），并使用t－SNE图对来自8位患者的多达12，323 hTEC和8，929 hPNEC转录组进行汇总，批处理校正，聚类和可视化（图1B，1C和S1C）。
附图1A：t－SNE聚类后的亚群注释
附图1B：t－SNE图中的内皮细胞
图1B：hpNEC和hTEC的t－SNE图
图1C：整合后的t－SNE图（对不同亚群进行颜色注释）
为了确保批次校正不会删除相关的生物学特征，作者分别分析了每个样品，发现在批处理校正后的数据中检测到的聚类与未进行批处理校正所获得的聚类非常相似。为了评估簇的可重复性，作者进行了分层聚类和自举分析（图S1D）
附图1D：在患者标本中对于所有细胞的聚类结果
对于无法通过自举分析分离的的生物学相关亚型（例如，来自肿瘤和肿瘤周围组织的淋巴EC），作者根据先前的研究，确定它们在统计学上是可以使用成对差异分析来分离的。13个表型中的每一个都按图1C所示编号（H1，H2等）。
作者根据hPNEC和hTEC中排名最高的标记基因的相对丰度对亚型进行生物学注释，并对显著的标记基因表达水平差异进行统计量化以支持定性生物学注释（图1D–1G和S1E）。
图1D：t－SNE聚类后的亚群标记基因的表达分布情况
E：标记基因在不同亚组中的表达热图
F：在hTECs和hpNECs不同EC亚型的占比
G：每种亚型在hTEC和hpNEC中的占比情况
为了获得更可靠的解释，作者关注不同亚型的特异基因集并基于规范的基因集（表S5）对亚型进行分析。为了提高分析的通用性，所有聚类的分类都被分析了至少一次。
作者对先前记录亚组中排名最高的标记基因作用的详细描述，用于推断每个亚型的假定生物学作用。
表S5（部分）：用于定义聚类的基因集
作者对于每一个聚类的通过其高表达基因集进行了生物学功能的分析：
动脉EC（簇H1）表达的基因涉及血管完整性，体内稳态和血管收缩（图2A），而毛细血管后静脉EC（H2）表达的基因与白细胞募集，组织灌注和肺动脉血压有关（图2B）。
作者确定了I型（H3）和II型（H4）肺泡毛细血管EC表型，其特征在于血管性血友病因子（vWF，II型相比I型上调；倍数＝ 3．63，adj．p＜0．001）和黏蛋白（EMCN，I型与II型相比上调；倍数＝ 2．89，adj．p＜0．001），它们可能分别参与血管调节和抗微生物防御（图2C– 2E）。
与所有其他簇相比，毛细血管内皮细胞表达了参与MHC－II介导的抗原呈递和加工的基因，其表达水平高于其他表型（图2F），但共刺激分子CD80和CD86却未检测到，提示其具有专职抗原呈递细胞（APC）的功能。
确定了2种可能由肿瘤源性细胞因子诱导的新型毛细血管表型：清除毛细血管（scavenging capillaries ）（H5）在自举分析结果中显示出类似于II型毛细血管内皮细胞的特征，而其清除受体和与巨噬细胞及抗原加工相关的基因上调表达（图2G，2H 和S1D），激活毛细血管（H6）则表达EC激活标记（图2I）。
中间毛细血管EC表型（H7）类似于活化的毛细血管，但其主要由单个患者衍生的细胞组成。
图2：肺正常组织EC各亚型的基因表达差异情况
作者随后探究了在肿瘤组织中特异性的EC，结果显示：
传统的血管生成表型，例如tip和增生的EC（假定为抗血管生成治疗［AAT］的靶标），仅在hTEC中可检测到（图3A，S1E和S2A）。tip EC（H8）与EC迁移，基质重塑和血管内皮生长因子（VEGF）信号传导相关的基因特征相关（图3B），但其仅在少数（＜10％）hTEC中被检测到（图S1E）。
值得注意的是，tip hTECs显示出疾病特异性分子PGF（胎盘生长因子；PlGF ）的高度限制表达。
发现了一个不成熟的hTEC表型（H9）与tip EC相似，但是其上调的基因参与了新生血管的成熟，血管屏障完整性和Notch信号转导，作者推测其可能类似于茎状EC（图3C和S1D） 。
仅在一部分患者中检测到增殖的hTECs，占hTECs的＜1％，并且在批量校正后不再作为单独的簇被检测到（图S2A）。
在hTECs中，激活的毛细血管后静脉表型（H10）上调表达了免疫调节因子和核糖体蛋白（图3D），这是发炎组织中高内皮小静脉（HEVs）的特征。
与血管内皮细胞广泛的表型异质性相反，肿瘤和肿瘤周围淋巴内皮细胞（LEC；H11，H12）的基因表达特征高度相似，并且未检测到LEC亚群（图3E和S1）。
图3：A：hnNEC与hTEC之间的EC表型差异
D－C：不同EC之间的基因表达差异
附图2A：各样品中增殖EC的存在情况
为了探索本研究中采用的NSCLC EC分类标准的通用性，作者使用了排名最高的标记基因来训练机器学习算法，以自动注释方式从来自5位未接受过治疗的NSCLC患者（公开数据集）的肿瘤的52，698个细胞目录中以计算机方式注释574个hPNEC和638个hTEC。大多数EC分类具有高置信度注释（相似性阈值＞ 0．5）（图3F），这表明分类法是外部有效的。
图3F：将hTEC和hPNEC表型与组织分类相关联的桑基图
作者使用正交技术以验证分类法的可靠性，通过免疫染色结合定量RNA杂交计数转录本数期望证实CD31 ＋ ／ CXCR4高tip hTECs中的PGF水平被上调
免疫染色：
三重免疫染色显示CXCR4和PlGF在TEC中共定位（图3G和3H； S2B）。
SELP的免疫染色证实了激活的毛细血管后静脉EC的特征（图S2C和S2D）
vWF和EFNB2分别为静脉和动脉表型（图S2E–S2H）
HEV特异性MECA－79抗原是HEV表型的特征（图S2I）
图3G：细胞中转录本PGF和CXCR4的表达情况及计数
图3H：NSCLC肿瘤血管的RNAscope图像（CXCR4（白色）PGF（绿色）CD31（红色）细胞核（Hoechst））
附图2B：对CD31，PLGF和CXCR4免疫染色的人NSCLC肿瘤切片的代表性显微照片
附图2C－H：NSCLC肿瘤切片（左）正常肺（右侧）的免疫荧光照片
I：对CD31和MECA79免疫染色的人NSCLC肿瘤切片照片
RNAscope：
RNAscope结合EC标记CD31的染色显示，动脉（EFNB2）和静脉（ACKR1）标记转录本不在同一hTEC中共定位（图S3A和S3B）
活化毛细血管hTECs表达了标记CCL14（图S3C）。
清除毛细血管标记CD52和CD68以及I型毛细管标记EDNRB和IL1RL1的转录本共定位在同一hTEC中（图S3D和S3E）。
附图3：NSCLC样品中EC细胞的RNA原位杂交结果
作者使用飞行时间质谱分析（CyTOF），使用针对这些细胞的26种预选标记的金属结合抗体，对从NSCLC样品中新鲜分离的单个的癌症、EC和基质细胞中的标记基因的蛋白质水平进行了定量。
图3I－K：I：CyTOF数据的t－SNE图，以不同颜色区分基质和癌细胞表型
J：通过CyTOF在基质细胞亚群中定量HLA－II表达
K：通过scRNA－seq和CyTOF分析鉴定的EC表型的层次聚类 CyTOF识别的簇以蓝色表示。
图S4：A－B：根据CyTOF数据进行t－SNE后细胞的来源情况展示
C－D：t－SNE中不同标记蛋白的表达
E：EC表型指示标记蛋白的表达水平条形图
F：hTECs和hPNECs中指示标记蛋白表达水平条形图
CyTOF单细胞数据的无偏聚类和t－SNE可视化揭示了EC，基质和癌细胞的独立簇（图3I和S4A–S4D）
与scRNA－seq一致，作者检测到I型（vWF－low）和II型（vWF－high）肺泡毛细血管EC，毛细血管后静脉EC（ACKR1－high ／ vWF－high）以及淋巴hPNEC和hTEC表型（PROX1－high）（图S4E）。
表达最高CXCR4（tip EC标记）水平但下调毛细血管标志物（CD36，CA4，HLA－II蛋白）的表型可能代表血管生成性hTEC。
检测到一个较弱的簇，作者将其认定为假定的活化毛细血管：与I型和II型毛细管相比，其毛细血管标志物（CA4，CD36，HLA－II）表达降低，但静脉TEC标志物vWF和tiphTEC标志物水平升高 CXCR4（图3J和S4E）。
CyTOF证实了毛细血管内皮细胞中HLA和CD36的水平升高，并在hTECs中被下调（图3J和S4F）。
为了验证使用scRNA－seq和CyTOF鉴定出的种群一致的观察结果，作者使用关键表面标记物（STAR方法）进行了层次聚类（图3K）。
LEC和毛细管EC聚集在一起，静脉EC与血管生成EC聚集在一起。
值得注意的是，多尺度自举分析表明，scRNA－seq解析的I型和II型毛细管EC最类似于其CyTOF对应物，这一结果在mRNA和蛋白质水平上交叉验证了2种不同的毛细血管表型的存在。
2．EC表型异质性可能的临床意义
尽管所有患者均未接受过早期治疗，作者仍在不同EC表型的相对分数中观察到了患者间异质性（图4A）。
在hPNEC中，检出的动脉，毛细血管，静脉和淋巴EC的比例各不相同，尤其是毛细hPNEC表型。
在hTECs中，毛细血管EC的数量减少了，这一结果已通过免疫组织化学证实（图4B）， 尽管每个患者的程度不同。
腺癌中不成熟的hTECs较鳞状细胞癌更为丰富。
图4：A：患者间EC表型的分布情况
B：以CD31和CD36免疫染色的人肿瘤周围组织（上）和NSCLC肿瘤（下）照片及定量
为了将EC表型特异性基因标记的表达与NSCLC患者生存相关联，作者利用了癌症基因组图谱（TCGA）的1，024个NSCLC患者的bulk RNA－seq数据集。利用公开资源（STAR方法）为每种表型鉴定EC特异性标记基因集后，作者使用基因集变异分析（GSVA）对1，024个中的每个标记的富集程度进行NSCLC患者评分，并分组进行生存分析。
鳞状（但未见腺癌）的NSCLC患者中拥有表达高水平的血管生成tipEC，
未成熟，活化的毛细血管后EC或淋巴TECs基因组特征的部分，这些患者总生存期较短，可能是因为这些特征反映了活跃的血管生成和淋巴瘤传播（图4C）。
图4C：对于TCGA来源数据使用GSVA根据EC表型分组后生存分析结果3．其他物种和模型中的肺肿瘤EC表型
为了比较跨物种的肺TEC分类法和模型，以在整合一致性分析中识别常见的血管生成TEC表型和靶标，作者使用了与人类来源相似的分析策略来构建了另外2种肺TEC分类法，主要研究了两种模型中的TEC情况
显微分离的29，007个小鼠mNEC和mTEC，其中存在是否接受过抗VEGF治疗的分型
来自人肺肿瘤的6，512个培养的hcTEC。
这两者均来自于LLC模型，因为它依赖于血管生成血管萌芽（AAT的靶标），这与其他临床前小鼠NSCLC肿瘤模型不同。
与在人肺中一样，作者鉴定了富集到的mNEC的表型，这些表型分别表达动脉（M1），I型和II型肺泡毛细血管（M2，M3），静脉（M4）和淋巴性（M5）EC的典型标志物（图5A－5D和S5A –S5G）。
图5：A：小鼠模型实验流程 B：不同来源的EC在t－SNE分布情况
C：整合后的t－SNE图（对不同亚群进行颜色注释）
D：t－SNE聚类后的亚群标记基因的表达分布情况
图S5：A：mTECs和mNECs中EC表型的相对丰度。
BC：标记基因在不同亚组中的表达热图
D：所有已鉴定的mNEC和mTEC表型的不同基因表达谱的相关性热图
E：在hTECs和hpNECs不同EC亚型的占比
F：hTEC和hpNEC对不同亚型的贡献情况
图S5：G：在患者标本中对于所有细胞的聚类结果
H：mNEC和mTEC的t－SNE图（H2－Aa和H2－Ab基因的）
在鼠肺EC表型中所示的常驻内皮干细胞（ESC）标志物表达水平的热图。
J－K：Glycam1基因或HEV标记基因集的颜色编码的mNEC和mTEC的t－SNE图
II型肺泡毛细血管内皮细胞表达参与MHC－II抗原呈递，加工和负载的基因水平最高（图S5B和S5H），但不表达共刺激基因Cd80和Cd86。
与NSCLC一样，在肿瘤中毛细血管EC的比例不足（图S5A；表S3），mTEC中典型的毛细血管基因特征表达下调，包括MHC－II表达（图S5H）。
除了一个毛细血管TEC表型（M6）外，mTECs下调了Cd36（一种涉及脂肪酸摄取的基因）（图5D）
与人肺不同，鼠肺中的静脉EC表型表达了先前在大型肺血管中发现的常驻内皮干细胞标志物（Cd200， Bst1）（图S5I）。
检测到增殖的（M7）和tip的（M8）mTEC（图5C和5E）。鼠肺中增殖的mTECs比人肺肿瘤中的丰富，这与鼠肺肿瘤的更快生长以及NSCLC中可能的不同类型肿瘤血管形成相一致（图5D和S5E）。
检测到不成熟的mTEC表型（M9）（图5C）。
与人类EC一致，观察到高静脉可塑性并检测到TEC丰富的表型，包括大静脉EC（M10）和毛细血管后静脉EC（M11）（图5C）。
毛细血管后静脉mTECs上调了HEV标记（图S5J和S5K），通过免疫染色证实（图S6A和S6B）。
图S6：针对不同靶位的免疫染色的健康鼠肺（左）和鼠肺肿瘤切片（右）的免疫荧光照片
其余的鼠表型主要在mTECs中检测到（图5C和S5F）。
新指骨mTEC表型（M12）表达毛细血管和小动脉标记，而激活的动脉mTECs（M13）中观察到新动脉生成标记上调。
值得注意的是，只有mTECs，而不是mNECs，表现出以干扰素（IFN）响应和趋化因子的表达为特征的表型，参与免疫细胞募集和血管阻滞（M14）（图S5C）。
确定了以前无法识别的EC表型，作者将其称为突破细胞（M15），以及它们的推定前体，先裂解细胞（M16）（图5E－5G）。
突破细胞不仅上调TEC末端标记的表达，而且还上调VEGF诱导的足突玫瑰花介导的基底膜（BM）和胶原蛋白重塑的基因的表达。
免疫染色证实了蛋白质水平上的动脉，毛细血管，静脉和tipmNEC和mTEC表型的标志物表达（图S6C–S6J）。
在培养的hcTEC中，体内的动脉，毛细血管和静脉EC表型不再可检测到（图S7A和S7B）。
图S7：A：培养的hcTEC的聚类情况
B：标记基因在不同亚组中的表达热图
在hcTECs中可检测到典型的tipEC表型（C1），这是一种可塑瞬时表型（plastic transient phenotype ）。
如在培养中的EC繁殖中所预期的，检测到了增殖的hcTEC（C2）。可能与培养条件有关（存在转化生长因子b，血清中内皮－成纤维细胞转化的诱导剂）
鉴定到表现出内皮－间充质转化特征的表型（C3）（TAGLN，SERPINE1，FN1，CD44，）。
检测到一个上调核糖体基因的中间过渡表型（C4），表明EC表型正在采用另一种表型（图S7B）。
４．VEGF阻断剂对TEC表型差异敏感性的影响
使用mTEC分类法，作者探讨了特定的EC表型是否对抗VEGF AAT敏感（VEGFR2抗体［DC101］，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂［PTK787］）（图5H）。这些化合物的剂量都达到抑制病理性血管生成并减少肿瘤中的EC数量的并抑制肿瘤的生长水平（图S7C）。
图5H：不同药物治疗后mTEC表型的相对组成
图S7：治疗后的肿瘤重量比较
对照和AAT处理后的EC依旧有相同的cluster组成（图5H），表明AAT不会改变不同EC表型的整体转录组特征。
对单个EC表型的量化显示，tip 和突破TECs最敏感。毛细血管后静脉和增殖的TEC对VEGF阻滞较不敏感，而毛细血管TEC对PTK787治疗较不敏感（图5H），尚不清楚这是否是由于肿瘤从血管发芽转变为血管选择所导致的。
5．肿瘤血管紊乱的分子特征和VEGF阻断的作用
肿瘤血管结构混乱且功能异常，但缺乏详细的无偏分子足迹分析。传统上，AAT被认为可以修剪血管生成的EC，VEGF阻断疗法也被认为可以使异常的血管系统正常化。
作者探讨了抗VEGF治疗是否通过诱导更细微的基因表达变化来达成EC阻滞作用：
首先通过在成对差异分析中比较血管生成和非血管生成的表型来构建“正常”和“肿瘤血管紊乱”的基因特征，以鉴定差异表达的基因（经校正的p值＜0．01，｜FC｜＞1．5）。比较发现分别有18个和28个基因的表达水平显著升高，分别处于紊乱（tip，突破和未成熟的EC标记基因）和正常（包括毛细血管标记基因）表型中（图5I，5J，S7D和表S4）。
图5：I：18个紊乱基因signature在不同处理组的表达水平
J：紊乱基因signature中的基因的表达水平（黑色虚线左侧）和正常的signature（黑色虚线右侧）的表达水平，药物处理对这些特征的影响
使用18个紊乱基因signature的GSVA显示，肿瘤血管的紊乱被VEGF阻断部分逆转（图5I和5J）。
图S7E－F：药物影响后的基因改变GSVA分析
两种VEGFR抑制剂均降低了末端EC基因signature的表达（糖酵解；BM重塑）
同时增加了与成熟的体内稳态功能相关的signature的表达（抗原呈递，屏障， 和血管发育）（图S7E和S7F）。
因此，VEGF阻断不仅修剪，而且还调节了TECs以促进具有稳态功能的更静态和成熟的肿瘤脉管系统，表明部分肿瘤血管分子正常化。
6．保守的TEC表型和tip EC标记物的鉴定
先前的研究发现，替代性促血管生成信号的上调会使抗VEGF疗法的疗效受到耐药性的限制。
为了确定备选的血管生成候选物，作者假设跨物种和模型保守的TEC表型以及一致表达的基因可能是更稳定的血管生成候选物。
因此，作者进行了整合的单细胞转录组学，本体多组学和转录组学荟萃分析，以识别此类候选基因（图S8A）。
图S8A：整合分析流程
作者使用scRNA－seq数据来评估跨物种和模型的血管生成EC表型的相似性，使用标记基因集的成对Jaccard相似系数并应用主成分分析（PCA）进行可视化（图6A和S8A）。
图6A：针对跨物种的EC主成分分析
在体外，hcTECs失去了体内动脉，毛细血管和静脉的表型。体内hTECs和mTECs和末端EC转录组signature在培养的hcTEC中是保守的。
仅在培养的和小鼠的TEC以及某些NSCLC患者的hTEC中检测到具有增殖特征的EC。
新鲜分离的人静脉和鼠类未成熟TECs，以及中间的hcTECs高度表达核糖体基因，提示可塑性表型，并过渡到其他血管生成EC表型。
除了tip TEC ，其他表型都是模型或物种特异性的。由于tip TEC在所有测试的物种和模型中均表达了相似的标记基因标记，因此作者着重于确定一致的tip TEC标记。
为了构建tip TEC标记的排名列表，作者首先选择了296个保守的tip EC中富集的基因，这些基因在物种和模型的tip TEC中始终表达最高。
其次，对于每个保守基因，作者通过计算3个数据集中的每个标记基因等级的乘积来定义等级得分（在此列表中，始终在tip EC中上调最高的基因中的基因排名最高）（图 6B）。
图6B：保守的tip EC标记基因的一致性得分条形图
上图：按指示的生物学过程分类的50个排名最高的标记基因
下图：它们与基准数据集的交集
作者提取了在排名前50位的富集signature进行后续分析。
这些富集的signature包含了先前在tipEC中检测到的tip EC标记（ANGPT2，APLN，FSCN1，PGF，PLXND1，ADM，PDGFB，CXCR4等），但不一定在表达模式和功能水平上进一步表征。
50个排名最高的基因中有一半以前没有被描述为tip TEC标记（在肿瘤或生理性血管生成中EC的转录组学研究中未检测到）。
一致的末端TEC标记与迁移的末端EC表型相关，包括层粘连蛋白（LAMA4，LAMC1，LAMB1），基质细胞蛋白（SPARC，LXN），细胞骨架相关基因（VIM，MARCKS，MYH9，MYO1B）和细胞粘附分子（CD93， MCAM，ITGA5）。
确定了新的tip TEC丰富的转录因子（TCF4，SOX4，SMAD1）。
肿瘤中紊乱的血管结构阻碍了tipTEC的形态学鉴定：图S6J（见上）显示了tip EC标记物的异质表达，但标志物在肿瘤血管发芽的最前端及其在形态学tip EC中的表达不能被明确鉴定。
因此，作者使用了产后视网膜血管生成模型来验证LXN（Latexin）和FSCN1（Fascin）在血管前端的tipEC中的表达（图S8B）。为了证明其功能作用，作者研究了沉默这些tip细胞标记是否会影响tip细胞竞争能力。
图S8B：出生后第5天，固定物异凝集素B4染色指示脉管系统及LXN或FSCN1的免疫染色
作者沉默了人脐静脉EC（HUVEC；＞ 70％–80％的沉默效率；图S8C）中的LXN（ ［shRNA］敲低）或FSCN1（siRNA沉默）表达，并生成了包含1：1对照野生型HUVEC（红色）、FSCN1（绿色）和被LXN沉默的HUVEC混合物的镶嵌球体。沉默的细胞很少出现在尖端位置，这证实了这些标记物在tip EC中的作用（图6C和6D）。
图6C－D：C：LXNKD D：FSCN1
照片：EC椭球的代表性显微照片 右：对具有指定基因型的tip细胞的分数进行定量7．综合分析强调胶原蛋白修饰参与血管生成的作用
编码胶原蛋白（COL4A1，COL4A2，COL18A1）的基因在最一致的tip EC标记中排名前10位，而其他胶原蛋白修饰（交联）酶（PXDN，PLOD1）则排名前50位（图6B，见上）。
对13名独立的NSCLC患者进行bulk RNAseq和验证性RT－PCR分析表明， TECs中参与胶原蛋白交联及羟化水平的基因（LOXL2PLOD1－3）表达高于NECs（图6E和6F）。
图6E－F：通过（E）bulk－RNAseq或（F）qRT－PCR的编码胶原羟基化和交联酶的基因的表达水平
为了探讨其他肿瘤类型的TECs中胶原修饰酶是否上调，作者对来自五种癌症患者的bulk RNAseq公开数据集中的NEC与TEC进行了整合分析。
在此分析中，编码胶原蛋白修饰酶的转录物同样被富集（对于所有基因，p ＜0．05），并排在TEC中最一致上调的基因的前1％–5％之间（图6G）。
图6G：排位与富集得分图
为了探讨蛋白质水平上TECs中胶原蛋白修饰酶是否上调，作者对来自肺，肾和结直肠（CRC）肿瘤和结直肠肝转移的144个预期收集的TEC和NEC样本的内部生成队列进行了蛋白质组学分析 （CRCLM）。
在来自NSCLC患者（n ＝ 27例）的TECs中，LOXL2是最高上调的蛋白（＞ 4倍），而PLOD1和PLOD2上调了1．7倍和1．9倍（图7A）。对所有4种肿瘤类型的荟萃分析均确定了288种持续表达较高的蛋白，包括LOX、LOXL2、PLOD1和PLOD2（图7B）。
图7：A：来自NSCLC患者的TECs中蛋白质表达差异
B：TEC中过表达的蛋白质在不同种类癌症的情况
对持续表达水平较高的蛋白质子集的GO富集分析显示，高表达蛋白质在糖酵解酶，生长和肌动蛋白细胞骨架组织以及蛋白质羟基化和交联的基因集富集（图7C和S8D）。
图7C：蛋白质的GO分析结果
作者将PLOD1，PLOD2和LOXL2以及蛋白质羟基化基因确定为高度排名的靶标，因此作者决定评估这些基因是否在功能上调节了血管的发芽。
与上述GO分析一致：
TEC中的迁移，增殖和血管发芽高于NEC（图8A－8C）。
图8A：NEC与TEC的划痕实验结果
B：3 H－胸苷掺入试验结果
图8C：C：hcNEC和hcTEC球状体发芽的明场照片（上图）和形态定量（下图）
HUVEC中PLOD1，PLOD2或LOXL2的沉默（沉默效率＞ 70％–80％；图S8E）减少了EC迁移（图8D），并削弱了HUVEC椭球中的血管发芽（图8E和8F）
D：对照和PLOD1，PLOD2或LOXL2沉默（KD）EC划痕试验定量结果
E－F：使用对照和PLOD1，PLOD2或LOXL2沉默（KD）EC进行的球状体发芽的明场照片（E）和定量（F）
米诺地尔是一种药理学上的PLOD阻断剂，可在体外减少EC迁移（图8G）。米诺地尔或赖氨酰氧化酶抑制剂β－氨基丙腈（BAPN）的施用可抑制体内角膜血管生成（图8H）。
图8G：米诺地尔对PLODs具有药理学抑制作用的EC的划痕伤口迁移试验
H：在用媒介物（CTRL），米诺地尔或β－氨基丙腈（BAPN）干预角膜烧灼诱导的损伤后的角膜血管新生。
总体而言，作者认为功能验证表明，通过综合分析确定的靶向基因可抑制血管发芽。
小结
在这篇文章中，作者针对人类，小鼠以及培养细胞株进行表皮细胞的深入分析，确定了不同model中的EC的异质性以及保守性，在确定EC亚型的研究中，作者不单单对自身数据集进行探究，还引入了多个外部数据集对于相关结论进行验证。作者还通过使用免疫荧光染色，RNA定量荧光染色以及cytof的方法来多维度确定EC的分类。
文章的后半部分关注于肿瘤治疗中的重要话题——抗血管生成进行研究，作者首先对小鼠样本中带有的抗VEGF治疗组进行差异基因筛选构建gene signature。为了确定相应的治疗靶点，作者首先鉴定了在研究中不同model最保守的EC亚型——tip EC，对该亚型进行保守基因的计算以及验证。随后，作者对这些鉴定出来的保守基因中胶原相关酶靶点进行验证，通过多种手段及实验技术证明了胶原羟基化及交联酶在肺癌EC细胞相关的血管生成的重要性。
作者在文章最后提到本文的局限性：首先，该研究中每种EC表型的生物学作用是推定的，需要进行更进一步功能验证以探测其生物学作用。其次，需要分析更多的患者，以探究患者之间的异质性，以识别所有可能的TEC表型。第三，两种物种的肿瘤生长不同，患者来源的肿瘤表现出比小鼠更大的遗传和环境异质性，这种异质性给研究TEC表型所带来的干扰是不能忽视的。
