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文章背景简介
BACKGROUND INTRODUCTION
CRISPR-Cas9基因组编辑系统由于精确靶向关键癌基因和肿瘤抑制因子的能力，在癌症治疗中具有巨大的潜力。目前使用CRISPR-Cas9进行癌症治疗的临床试验主要集中在从患者身上分离提取T细胞，对其进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑，随后将其重新注入患者体内。目前，安全有效地操作肿瘤微环境中的特定基因组序列仍然是 CRISPR-Cas9 在癌症治疗中临床应用的重大挑战。要取得令人满意的抗癌疗效，CRISPR-Cas9疗法必须解决编辑细胞在体内的适应性这一重要问题。肿瘤细胞的癌基因和细胞死亡相关基因通常被选为 CRISPR-Cas9 疗法的编辑靶标。然而，经过编辑的细胞通常会表现出适应性降低、增殖减少以及对细胞凋亡的敏感性增加，这可能导致肿瘤微环境中的肿瘤细胞迅速占领肿瘤组织，最终降低基因编辑工具的抗癌疗效。因此，安全有效地操纵肿瘤微环境中的特定基因组序列仍然是CRISPR-Cas9在癌症治疗中的临床应用面临的重大挑战。
瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境的重要组成部分，在血管生成、细胞外基质重塑、癌细胞增殖、转移和免疫抑制的协调以及对化疗药物和检查点阻断免疫疗法的耐药性中发挥作用。TAM在功能上是异质性的，分为两个主要亚群，M1和M2巨噬细胞。M1型TAM的存在与抗肿瘤活性相关，而M2型TAM的存在与促肿瘤活性相关。使用CRISPR-Cas9，可以敲除几个相关基因，从而永久地将TAMs重塑为抗肿瘤M1样表型，同时保持其适应性。这些表型稳定的巨噬细胞可以持续发挥抗肿瘤作用，而不屈服于免疫抑制的肿瘤微环境，从而最大限度地发挥基因编辑治疗的功效。因此，除了肿瘤微环境中的肿瘤细胞外， 瘤相关巨噬细胞TAMs也是增强基因编辑治疗癌症功效的重要靶标。
有效的递送载体对于CRISPR-Cas9基因组编辑系统在体内的成功应用至关重要，因为它们必须准确地将系统转移到靶细胞的细胞核中。目前，可用的基因组编辑工具有三种模型:基于质粒的CRISPR-Cas9系统、sgRNA/Cas9 mRNA混合物和Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)。在这些模型中，Cas9-sgRNA RNP递送由于其编辑速度快、脱靶效应小、免疫反应弱而优势明显。然而，Cas9-sgRNA RNP的高分子量和易降解阻碍了其通过常规给药的方式在体内的应用。最近，细菌衍生的囊泡已成为有前途的药物递送系统。细菌可以通过基因修饰赋予囊泡体内靶向特性和包封内源性表达治疗剂的能力。然而，为了充分发挥细菌衍生载体的临床潜力，必须解决其内毒性、低产量和装载成分不确定性的障碍。
为了实现高效安全的传递CRISPR-Cas9基因组编辑系统，南京大学Mingming Zhao等人，开展了相关研究，并于2024年在《Nature Communications》杂志（IF=16.6，Q1）发表了题为“Bacterial protoplast-derived nanovesicles carrying CRISPR-Cas9 tools re-educate tumor-associated macrophages for enhanced cancer immunotherapy”的文章。
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所用到的主要方法
METHODS
1、半乳糖(DGA)的合成
2、差示扫描量热分析
3、质粒构建
4、ELISA
5、细胞流式
6、PCR
7、Western blot
8、免疫病理检测
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文章主要内容摘要
ABSTRACT
CRISPR-Cas9基因编辑系统能够精确靶向肿瘤发生和免疫反应，在癌症治疗具有巨大的潜力。但该系统面临着严峻的挑战，如无法保持编辑后的细胞活力和确保在体内安全传递。为了解决这些问题，研究人员利用细菌原生质体衍生的纳米囊泡(NVs)开发了一种体内CRISPR-Cas9靶向肿瘤相关巨噬细胞(targeting tumor-associated macrophages, TAMs)的系统。这种囊泡利用质粒转化的大肠杆菌原生质体作为生产平台，经pH响应性PEG共轭磷脂衍生物和针对TAMs靶向定制的半乳糖胺共轭磷脂衍生物修饰，加载了靶向巨噬细胞极化的Cas9-sgRNA核糖核蛋白Pik3cg和TLR9的配体CpG的DNA片段。加载CRISPR-Cas9工具的菌源外泌体通过稳定TAMs中的M1样表型来重塑肿瘤微环境，从而抑制雌性小鼠的肿瘤生长。该研究结果为癌症免疫治疗开辟了道路，克服了基因编辑细胞在体内维持活性、安全和精确靶向递送相关的挑战。
简而言之，本研究的主要内容有：
1、 靶向TAMs特异性Pik3cg基因组编辑的纳米囊泡大肠杆菌原生质体的制备
2、 大肠杆菌原生质体衍生NVs成分分析
3、 体外靶向递送sgPik3cg-DHP/DGA-NVs至M2样巨噬细胞
4、 sgPik3cg-DHP/DGA-NVs对M2样巨噬细胞体外复极化的影响
5、 体内递送sgPik3cg-DHP/DGA-NVs到TAMs激活M1样表型
6、 sgPik3cg-DHP/DGA-NVs抑制肿瘤生长
7、 sgPik3cg-DHP/DGA-NVs治疗重塑肿瘤微环境
【往期相关链接】：
基于CRISPR/Cas9的等位基因驱动，可以逆转昆虫对杀虫剂的抗性
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