01
文章背景简介
BACKGROUND INTRODUCTION
白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，口感柔和，香气独特，回味持久。白酒的酿造包括原料准备、大曲生产、酿造、蒸馏、陈酿等步骤。其中，大曲是白酒酿造的关键发酵剂。浓香型白酒的酿造过程中，大曲不仅为酿造提供了原料，而且提供了丰富的微生物，如乳酸杆菌、芽孢杆菌、曲霉菌、根霉、酵母菌等，这些微生物会产生多种酶，包括淀粉酶、酯酶、蛋白酶等。大曲中的功能酶，如淀粉酶和蛋白酶，决定了中国白酒酿造过程中谷物大量营养素的水解，营养物质的分布和微生物的代谢都受到这一水解过程的影响，这也影响了白酒的风味发展。例如，微生物分泌蛋白酶将蛋白质分解成氨基酸，为风味化合物提供前体，或通过分泌酯酶促进酯的合成。同时，这些微生物在代谢过程中会形成各种味道成分，有助于白酒风味的增强。
大曲为白酒的发酵提供了多种微生物和酶，这对白酒的质量和风味化合物的形成产生了重大影响。近年来，对大曲酶系统的研究主要采用元转录组学或元蛋白质组学方法。根据来源分析，大曲为中国白酒发酵提供了10%-20%的细菌群落和60%-80%的真菌群落，进一步证实了微生物群落在大曲酿造过程中的贡献。虽然许多报道揭示了大曲的微生物系统，但对大曲的蛋白或酶系统的了解依然有限。
宏蛋白质组学（也称为社区蛋白质组学、环境蛋白质组学或社区蛋白质基因组学）是研究环境来源微生物群落和微生物组中所有蛋白质的实验方法的总称。宏蛋白质组学用于对处理从复杂微生物群落中识别和定量的所有蛋白质的实验进行分类。宏蛋白质组学方法类似于以基因为中心的环境基因组学或宏基因组学。
为了揭示浓香型大曲主要糖化酶及其来源菌株和相关代谢过程，调节大曲的生产过程，提高中国白酒的质量。2023年，四川大学生物质科学与工程学院Muwen He等人，在《International Journal of Food Microbiology》杂志（IF 5.4；微生物学1区）发表了题为“Metaproteomic investigation of enzyme profile in daqu used for the production of Nongxiangxing baijiu”的文章。作者采用宏蛋白质组技术对浓香型大曲的蛋白质组成和功能进行了分析，重点研究了大曲中的糖基化酶。在此基础上，采用可培养的方法对大曲中产生糖基化酶的菌株进行了筛选。这些结果有助于进一步了解浓香型大曲的酶谱，揭示其主要糖化酶及其来源菌株和相关代谢过程，有助于调节大曲的生产过程，提高中国白酒的质量。
02
所用到的主要方法
METHODS
（1）蛋白质提取和肽酶解：通过SDT（4%（w/V）SDS，100mM Tris/HCl，pH 7.6，0.1M DTT）提取蛋白质，然后通过BCA定量。从每个样品中取适量的蛋白质，使用助滤蛋白制剂（FASP）法进行胰蛋白酶水解。然后使用C18柱（Sigma）对酶水解的肽进行脱盐。肽冷冻干燥后，加入40μL溶出缓冲液，以OD280定量肽含量。
（2）LC-MS/MS数据采集及蛋白质鉴定与定量分析
（3）关键糖化酶的鉴定
（4）酶活性测定
（5）糖化酶产生菌株的筛选与鉴定
03
文章主要内容摘要
ABSTRACT
大曲中的酶和微生物群是酿造浓香型白酒所必需的。揭示大曲中的关键酶和功能菌株有利于改善浓香型白酒的风味和品质。作者采用宏蛋白质组技术对浓香型大曲进行酶谱分析，筛选出具有较高糖化活性的菌株。在大曲中共鉴定出933种蛋白，其中酶类蛋白463种，其中氧化还原酶140种，转移酶98种，水解酶91种，连接酶49种，裂解酶41种，异构酶27种，水解酶是白酒酿造中丰度最高的酶。在水解酶中，共鉴定出36个碳水化合物代谢相关酶(CMEs)，其中12个是与糖苷水解相关的关键酶。鉴定出4种主要的糖苷水解酶:葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖酶(EC 3.2.1)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，它们的来源分别为Byssochlamys spectabilis、Lichtheimia ramosa、Thermoascus aurantiacus。然后通过培养依赖性方法筛选出产糖苷水解酶能力较高的Aspergillus A2、A3、A7、Lichtheimia L1、L4、L5和Saccharomycopsis S2、S4、S6菌株。本文结果进一步揭示了大曲的酶谱，鉴定了大曲的主要功能菌株，为浓香型白酒的酿造提供理论支持。
简而言之，本研究的主要内容，首先采用宏蛋白质组学技术测定了浓香型大曲的酶谱；其次揭示了大曲中的主要功能酶及其代谢途径；然后基于KEGG数据库和CAzy数据库鉴定了大曲中的关键糖化酶；最后采用可培养技术筛选出大曲产糖苷水解酶菌株：
1、 浓香型大曲的蛋白质图谱
2、 浓香型大曲的酶类及其主要功能
3、 大曲中已鉴定酶主要功能的阐明
4、 参与碳水化合物代谢的关键酶的鉴定
5、 糖化酶产生菌的分离与特性研究
【往期链接】：
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本研究室授权发明专利2件：具有优良酒精耐受及解酒能力的2株益生菌
