01
文章背景简介
BACKGROUND INTRODUCTION
维生素B12在人体生理学中扮演着至关重要的角色，其缺乏可能导致周边动脉疾病、巨幼红细胞性贫血、心血管和神经系统障碍。微生物，是人类通过食用动物组织和相关食品产品所能获得的唯一维生素B12来源。因此，定期摄入这种维生素对于预防任何临床前或临床症状是必要的。
植物性饮食习惯的人群更容易出现维生素B12缺乏。通过食品级生物体的发酵和化学强化是将这种维生素添加到植物性食品中的仅有的两种方式。然而，维生素B12的生产潜力并不是所有食品发酵微生物都具备的，只有某些丙酸杆菌和乳酸杆菌（LAB）的菌株显示出食品B12生物强化的潜力。其中涉及到一系列生物转化过程，例如：cbiK基因编码钴螯合酶，它在厌氧和B12特异性的方式下，将钴离子整合到钴胺素的四吡咯环中心。
豆奶是牛奶的一种廉价替代品，基本上以其高蛋白质、必需氨基酸、叶酸和多不饱和/饱和脂肪酸（1/1:0.3）含量而闻名，由于缺乏B12，它成为使用食品发酵进行钴胺素生物强化的首选食品基质。
对于像食品发酵这样的复杂生物系统，实验设计的最佳化是一个繁琐的问题，以确保不变性并提高有效性，特别是在处理多级因素时。除了传统的和多功能的单因素实验法（OFAT），还建议使用广义子集设计（GSD）作为设计实验的工具。此外，人工神经模糊推理系统（ANFIS），即学习工具（人工神经网络）和强大系统（模糊逻辑）的结合，可以预测统计实验设计的有效性、目标生物分子的最大生产水平以及发酵变量之间的相互关系。
为了从人类粪便样本中筛选可胞外生产维生素B12的乳酸杆菌，并通过OFAT-GSD-ANFIS方法，实现豆奶的最大原位VB12生物强化，印度国家乳品研究所的Manorama Kumari等人开展了相关研究，并于2021年在《Current Research in Food Science》杂志（IF2021=6.269，当前IF6.3；农林2区）发表了题为“Vitamin B12 biofortification of soymilk through optimized fermentation with extracellular B12 producing Lactobacillus isolates of human fecal origin”的文章。
02
所用到的主要方法
METHODS
1、PCR扩增
2、琼脂糖凝胶电泳
3、厌氧-微需氧两段发酵
4、UFLC检测定量
5、微生物测定法
6、OFAT-GSD-ANFIS设计预测
03
文章主要内容摘要
ABSTRACT
该研究旨在生物强化豆奶（本身是一种不含维生素B12的植物食品基质）。基于PCR的筛选表征了人粪便样品（15份检测样品中的4份），并相应鉴定了新型乳杆菌分离株（n=4）的VB12生产潜力，其余（n=62）的该属性为阴性。此外，4个选择的菌株中的3个显示出胞外维生素生产能力。在无钴胺素的培养基中，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）F2的B12分泌量为132.2±1.9μg/L，其胞外/胞内分泌比例为0.97/1.00，是截止论文报道时的最高水平。在下一阶段中，在未优化（2.8±0.3μg/L）和优化（156.2±3.6μg/L）发酵期间用VB12原位生物强化豆奶，其中在基于人工神经模糊推理系统的R值>0.99时增加约54倍。添加的营养物质，温度和初始pH值被认为是最大的VB12生物强化的最重要的发酵变量。该实验室还报道获得了第一株产VB12（101.7±3.4μg/L）的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）F5。此外，维生素在营养缺陷型突变体中是生物可利用的。因此，用特定乳酸杆菌发酵是一种有效的VB12生物强化豆奶的制备方法。
简而言之，本研究的主要内容有:
1、基于PCR的人类粪便样本和相应乳酸杆菌的维生素B12筛选
2、维生素B12在BCM中的生物生产（胞外/胞内）
3、通过乳酸杆菌发酵对豆奶进行维生素B12生物强化
